布比卡因是临床常用的局部麻醉药（local anesthetic,简称局麻药）,也常用于治疗急性及慢性疼痛,布比卡因的毒性强于其他局麻药。机体过量的布比卡因暴露可引起中枢神经系统毒性和心血管系统毒性;但是与诱发心血管毒性相比,布比卡因诱发中枢神经系统毒性的血药浓度更低。至今布比卡因等局麻药引起神经毒性的机制仍未阐明。以大鼠海马切片为标本的研究结果显示,局麻药可以抑制海马的长时程增强现象。据报道,海马对局麻药诱发的惊厥高度敏感。但是关于局麻药对原代培养海马细胞的作用却鲜有报道。谷氨酸是参与人脑高级功能的重要神经递质,因此我们采用原代培养的胎鼠海马神经元及星形胶质细胞,利用免疫荧光技术、钙成像技术和双光子显微镜技术,观察了布比卡因对谷氨酸介导大鼠海马星形胶质细胞及神经元细胞内游离钙(intracellular free Ca²⁺concentration,[Ca²⁺]_i)升高的影响,布比卡因对大鼠海马星形胶质细胞及神经元线粒体膜电位及活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成的影响,以及布比卡因对大鼠海马星形胶质细胞谷氨酸转运功能的影响。第一部分布比卡因对谷氨酸诱导大鼠海马细胞内钙升高的影响目的:探究布比卡因对谷氨酸介导的神经细胞钙信号的影响。方法:原代培养大鼠胎鼠海马神经元及星形胶质细胞,应用免疫荧光技术鉴定单独培养的神经元及星形胶质细胞的细胞纯度。利用钙成像技术记录谷氨酸对两类神经细胞[Ca²⁺]_i的作用及布比卡因对谷氨酸诱导的神经细胞[Ca²⁺]_i变化的影响。结果:1.谷氨酸对单独或混合培养海马细胞[Ca²⁺]_i升高的比较星形胶质细胞单独培养时,首次给予1 mM谷氨酸（10 s）诱发细胞[Ca²⁺]_i上升的峰值为239±40%,与混合培养条件下星形胶质细胞首次暴露于1 mM谷氨酸时细胞[Ca²⁺]_i峰值（233±42%）相比,无显著性差异（P>0.05）。然而,海马神经元单独培养时,首次给予1 mM谷氨酸（10s）诱发细胞[Ca²⁺]_i上升的峰值为240±81%,该峰值显著高于混合培养条件下,首次给予1 mM谷氨酸诱发海马神经元[Ca²⁺]_i上升的峰值（169±20%,P<0.01）。2.布比卡因对谷氨酸诱发海马细胞[Ca²⁺]_i升高的影响在混合培养状态下,300μM布比卡因（孵育5 min）使星形胶质细胞对1 mM谷氨酸的反应显著减弱（P<0.01）。相反,当混合培养状态下的神经元与300μM布比卡因孵育5 min后,神经元[Ca²⁺]_i对谷氨酸的反应显著增强（P<0.01）。单独培养的星形胶质细胞与300μM布比卡因孵育5 min后,其对第二次谷氨酸刺激的反应显著下降（P<0.01）,峰值、曲线下面积和Tau值的变化程度与混合培养时相似。单独培养的神经元与同浓度布比卡因孵育5 min后,第二次给予谷氨酸所诱发神经元[Ca²⁺]_i上升的峰值,与布比卡因预处理前谷氨酸引起的神经元[Ca²⁺]_i变化相比,未见显著差异（P>0.05）。3.布比卡因及罗哌卡因对谷氨酸诱发海马细胞[Ca²⁺]_i升高的量效关系研究在混合培养状态下,两类细胞对布比卡因及罗哌卡因的反应均呈浓度依赖性。布比卡因对两类细胞的作用,自0.3μM开始起效,于300μM达峰值;布比卡因对星形胶质细胞作用的EC₅₀为1.64μM,对神经元作用的EC₅₀为1.76μM。罗哌卡因对两类细胞的起效浓度为3μM,峰值浓度为3000μM;EC₅₀分别为15.51μM（星形胶质细胞）和16.18μM（神经元）。小结:酰胺类局麻药显著抑制谷氨酸诱发的大鼠海马星形胶质细胞[Ca²⁺]_i升高却增强谷氨酸诱发的混合培养的神经元[Ca²⁺]_i升高。布比卡因对大鼠海马神经元的毒性作用(增强谷氨酸诱发的神经元[Ca²⁺]_i升高)可能源于其对星形胶质细胞的直接抑制作用。第二部分布比卡因对大鼠海马细胞线粒体膜电位及ROS生成的影响目的:探究布比卡因对海马细胞线粒体膜电位及ROS生成的影响。方法:培养原代大鼠胎鼠海马细胞,利用JC-1染料在双光子显微镜下观察布比卡因对细胞线粒体膜电位的影响,使用DCFH-DA染料及细胞内ROS荧光试剂盒并利用离子成像技术记录布比卡因影响两类细胞ROS的变化。结果:1.布比卡因对混合培养的海马细胞线粒体膜电位的影响对混合培养的海马细胞,给予300μM布比卡因处理后,神经元的线粒体膜电位未见明显改变;另一方面,给予300μM布比卡因后,星形胶质细胞的线粒体膜电位降低幅度达60%。2.布比卡因对单独培养星形胶质细胞线粒体膜电位的影响及环孢菌素A的逆转作用在单独培养状态下,神经元的线粒体膜电位依然不受300μM布比卡因的影响。与混合培养时相同,给予300μM布比卡因后,单独培养星形胶质细胞的线粒体膜电位出现显著降低。对单独培养的星形胶质细胞给予1μM环孢菌素A（cyclosporin A,CsA）预处理后,0.3-300μM布比卡因降低线粒体膜电位的作用受到显著抑制。3.布比卡因对单独培养星形胶质细胞ROS生成的诱导作用及CsA的逆转作用对单独培养的星形胶质细胞及神经元使用DCFH-DA染色后,给予300μM布比卡因不影响神经元内ROS的生成,但可显著增加星形胶质细胞内ROS的生成,增加幅度可达130%。若使用1μM CsA预处理5 min,可显著抑制300μM布比卡因诱发的ROS生成,抑制率达81%。小结:布比卡因可显著降低星形胶质细胞的线粒体膜电位,并显著增加ROS生成。但布比卡因无法对神经元的线粒体膜电位或ROS生成产生相似影响。Cs A可逆转布比卡因对星形胶质细胞线粒体膜电位的降低作用及ROS生成的增加作用。布比卡因很可能是通过损伤星形胶质细胞的线粒体功能,进而间接对神经元产生影响。第三部分布比卡因调节谷氨酸升高大鼠海马细胞内钙的相关机制研究目的:探究布比卡因对谷氨酸升高大鼠海马细胞[Ca²⁺]_i的作用机制。方法:培养原代大鼠胎鼠海马细胞,应用钙成像技术记录布比卡因对细胞[Ca²⁺]_i的影响。结果:1.无钙外液及丹曲林对谷氨酸诱发的单独培养神经元[Ca²⁺]_i升高的影响将钙成像实验中的含钙外液替换为含有5 mM EGTA的无钙外液后,再次对单独培养的神经元给予1 mM谷氨酸,此时谷氨酸无法产生诱发[Ca²⁺]_i升高的现象,联合使用300μM的布比卡因亦不能改变这一现象。对单独培养的神经元细胞使用10μM丹曲林预处理后,其对谷氨酸产生的[Ca²⁺]_i升高反应无显著改变（P>0.05）;300μM布比卡因联合10μM丹曲林预处理,亦对单独培养的神经元[Ca²⁺]_i升高现象无显著作用（P>0.05）。2.CsA抑制布比卡因对谷氨酸诱发海马细胞[Ca²⁺]_i升高的作用在混合培养状态下,使用300μM布比卡因联合1μM CsA孵育5 min后,布比卡因抑制谷氨酸诱发星形胶质细胞[Ca²⁺]_i升高的作用几乎消失;同样,布比卡因增强谷氨酸诱发海马神经元[Ca²⁺]_i升高的作用也几乎消失。3.谷氨酸转运体抑制剂对布比卡因作用的影响对混合培养的两类海马细胞,使用谷氨酸转运体特异性抑制剂二氢乙酸500μM预处理后,第一次给予1 mM谷氨酸所诱发星形胶质细胞[Ca²⁺]_i上升的峰值为284±53%,神经元[Ca²⁺]_i上升的峰值为237±156%。在二氢乙酸的存在下,300μM布比卡因仍可显著抑制第二次给予1 mM谷氨酸所诱发的星形胶质细胞[Ca²⁺]_i升高的作用（P<0.01）,但300μM布比卡因增强1 mM谷氨酸诱发神经元[Ca²⁺]_i上升的作用消失（P>0.05）。小结:谷氨酸主要通过外钙内流引起神经元内钙升高。CsA可逆转布比卡因对两类细胞内钙升高的影响。临床常用浓度的局麻药布比卡因直接作用于海马星形胶质细胞,损伤混合培养的星形胶质细胞线粒体,进而抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸的功能,导致培养体系中神经元周围的谷氨酸浓度升高,间接增强谷氨酸诱发的神经元[Ca²⁺]_i升高。结论:酰胺类局麻药显著抑制谷氨酸诱发的大鼠胎鼠海马星形胶质细胞[Ca²⁺]_i升高却增强谷氨酸诱发的混合培养神经元[Ca²⁺]_i升高,其作用机制与局麻药选择性阻滞钠离子通道的作用无关。临床常用浓度的局麻药布比卡因直接作用于海马星形胶质细胞,损伤混合培养的星形胶质细胞线粒体,进而抑制星形胶质细胞摄取谷氨酸的功能,导致培养体系中神经元周围的谷氨酸浓度升高,间接增强谷氨酸诱发的神经元[Ca²⁺]_i升高。