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研究背景食管癌（Esophageal cancer,EC）是人类消化道常见恶性肿瘤之一,属于全球性的公共健康问题。中国是食管癌的高发大国,最新数据显示新发病例数和死亡病例数分别占全球食管癌患病总数的53.7%和55.7%。食管癌的病理分型主要为食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma,EAC）,鳞癌占中国食管癌病例的绝大部分。ESCC患者的预后与确诊时的分期密切相关,由于缺乏特异性的早期诊断的方法和指标,多数患者确诊时已经处于晚期,5年生存率低于20%;但临床数据显示,早期无症状患者通过常规手术或内镜切除后,5年生存率可提高到90%以上。因此,寻找简便、特异、廉价、有效的早期诊断和筛查方法已成为EC防治的关键。我国曾使用过的食管拉网技术在EC的早期诊断探索中取得了较好的结果,但终因患者耐受性较差和灵敏度较低的限制被内镜技术淘汰。目前食管内窥镜作为临床的主要诊断方式,配合诊断色素和组织活检对于食管癌有较好的检出率和准确性。但该方法也存在一定的局限性,不适于作为早期诊断和大范围筛查方法。近年来,有大量关于肿瘤标志物应用于早期诊断的研究,已有相关标志物被用于ESCC的辅助诊断,但临床数据显示其敏感性和特异性存在不足,目前仍没有特异性的标志物可真正用于临床。Barrett’s食管炎特异性标志物Trefoil Factor3（TFF-3）联合食管脱落细胞的大规模筛查临床实验,证明了应用肿瘤标志物与细胞海绵富集食管脱落细胞筛查早期癌变细胞的可能性,为EAC的早期诊断提供了新的方法,也提高了EAC的早期诊断率。但是针对于ESCC和肿瘤标志物联用的研究仍然比较稀少,本研究通过对中国ESCC患者癌组织和配对的癌旁正常组织转录组测序信息分析,筛选出适合于ESCC的特异性肿瘤标志物,围绕新的特异性肿瘤标志物进行研究,探索对食管拉网技术的改良,并为开发ESCC的早期诊断方法和筛查方法提供新的思路和参考。目的本课题通过对120例配对的中国ESCC患者癌组织和相应癌旁组织的转录组测序数据进行分析,期望通过筛选差异表达基因,发现并验证ESCC的特异性的肿瘤标志物,探究相关标志物蛋白的表达情况、临床相关性。收集食管病变患者和非肿瘤患者的脱落细胞标本,验证该标志物作为ESCC早期诊断标志物的可行性,为改良食管拉网技术与ESCC临床的早期诊断方法和筛查方法提供依据。方法1.RNA测序分析筛选配对ESCC组织与正常食管组织差异表达基因利用120例配对的中国ESCC患者癌组织和相配对癌旁正常组织标本,经转录组测序并分析筛选出差异表达基因;对目的基因表达水平数值进行统计学分析,并计算灵敏度与特异度;分别利用生物信息学软件平台TIMER2.0、GEPIA、UALCAN对该目标基因进行泛癌化分析、表达量分析。2.免疫组织化学与蛋白质性质分析初步验证候选基因利用免疫组化技术对候选基因编码蛋白在EC组织中表达进行检测,通过蛋白水平分析进一步验证候选基因。利用NCBI的蛋白质数据库,下载蛋白质序列数据,然后利用信号肽预测软件Signal P和蛋白质跨膜结构预测软件TMHMM对目标基因编码蛋白质性质进行分析。3.免疫组织化学探究Laminin Subunit Gamma 2（LAMC2）在食管鳞癌组织样本中的表达与临床意义进一步验证目标基因LAMC2在食管鳞癌组织和癌旁正产组织中的表达,ESCC组织芯片大样本探究LAMC2蛋白质表达,分别统计食管鳞癌和配对癌旁组织中LAMC2的表达情况,统计学分析其和临床特征的关系。4.免疫细胞化学探究LAMC2在食管鳞癌细胞系和永生化食管鳞状上皮细胞中的表达免疫细胞化学法验证多种ESCC细胞系与永生化食管上皮细胞中LAMC2的表达,对比LAMC2蛋白在不同分化程度ESCC细胞中和食管上皮细胞中的表达差异和亚细胞定位。5.LAMC2免疫化学染色法探究对ESCC的诊断准确率利用临床食管病变患者的食管脱落细胞标本,以ESCC细胞系与食管上皮细胞染色结果为对照,然后利用LAMC2免疫化学染色结果作为可视化信号对癌变细胞进行识别,再与临床病理组织活检结果进行比较,对其诊断准确率与效率进行评价。6.统计学分析所有实验数据采用SPSS26.0进行处理,采用Graph Pad Prism 8.0.2进行作图处理,检验水平α=0.05（均采取双侧检验）,P＜0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.ESCC与正常食管组织差异表达基因筛选及对比分析（1）经分析120例中国ESCC患者配对组织转录组测序结果显示:CST1、LAMC2、EPPK1、DSPP、CA9、ANO1、CD276、EPCAM等基因在中国ESCC患者癌组织中的表达显著高于相对癌旁组织,Receiver Operating Characteristic Curve（ROC）曲线分析结果也显示CST1、CD276、LAMC2、CA9、ANO1和DSPP曲线下面积高于0.9,（P＜0.001）。（2）利用对比TCGA数据库中进一步验证我们所筛选相关基因表达,结果显示:以上八个候选基因在多种肿瘤中表达高于正常组织（P＜0.05）;唯有EPPK1基因m RNA表达量在正常组织和癌组织间无显著性差异。2.免疫组织化学初步验证候选基因、确定目标基因为进一步确定目标基因是否在肿瘤组织中高表达,用免疫组化染色初步验证以上候选基因在35例食管癌和相应癌旁组织中蛋白表达情况;发现CTS1（45%）、CA9（47%）、ANO1（67%）、DSPP（48%）在食管癌组织中的表达显著升高,在正常黏膜组织中低表达或未见阳性染色;EPPK1（82%）在食管癌组织中的阳性率较高,但阳性染色程度较弱;CD276（90%）与LAMC2（94%）在肿瘤组织中表达阳性率均高于90%,正常食管组织中低表达或不表达,但CD276可在部分肿瘤周围成纤维细胞和免疫细胞中呈现阳性表达,而LAMC2蛋白表达仅存在于肿瘤细胞中,LAMC2可能是比较好的潜在肿瘤标志物。3.LAMC2在ESCC组织中的表达及其临床意义ESCC组织芯片（92例ESCC组织、44例癌旁组织）免疫组化结果显示癌组织LAMC2阳性表达率88.1%,癌旁组织阳性率为22.7%,两组差异具有统计学意义（P＜0.05）;LAMC2的表达与ESCC肿瘤T分期呈正向相关性。4.LAMC2蛋白在食管鳞癌细胞系和永生化食管鳞状上皮中的表达LAMC2除在低分化的KYSE-70细胞质中呈现弱表达,在ESCC细胞系不同分化程度中的管鳞癌细胞的细胞质中均有中等或较强表达;食管永生化鳞状上皮细胞的LAMC2蛋白呈现弱表达或不表达。5.食管脱落细胞中LAMC2免疫细胞化学染色诊断食管癌的准确度对75例临床患者食管脱落细胞进行免疫细胞化学染色（包含45例食管鳞状细胞癌、3例食管高级别上皮内瘤变、5例食管腺癌、1例考虑小细胞癌、1例小细胞内分泌神经瘤、20例食管炎症或无明显异常患者）,对比临床内窥镜和病理诊断结果,食管脱落细胞的免疫染色与食管临床诊断的灵敏度、特异度和结果符合率分别为73.3%、80%和74.7%。结论1.LAMC2是在食管鳞癌中高表达,而在正常食管组织中低表达或不表达的一个潜在肿瘤标志物。2.LMAC2蛋白在食管癌组织中和食管鳞癌细胞中显著高表达,LAMC2蛋白的表达与患者的癌症病理分期呈正相关。3.LAMC2蛋白免疫化学法联合食管脱落细胞形态学检测有望成为ESCC潜在的临床早期诊断和筛查方法。