第一部分：海藻糖对过表达ALS相关毒性蛋白质NSC-34细胞的干预研究目的：本研究中，我们采用过表达ALS疾病相关蛋白质的细胞为模型观察海藻糖对这些毒性蛋白质的自噬性降解有无促进作用，并观察其能否减轻这些蛋白质对细胞带来的毒性作用。为探索自噬调控对ALS病理的影响提供体外实验依据。方法：用瞬时转染的方法在NSC-34细胞系中过表达WT TDP-43，与家族型ALS相关的Q331K TDP-43，M337V TDP-43突变蛋白质，TDP-43的C末端片段TDP-25和TDP-35，以及人WT SOD1和人突变型SOD1-G93A蛋白质。再给予用不同浓度的海藻糖（25mM、50mM和100mM）进行干预。用免疫印迹法检测LC3-II及P62这两种自噬通路的标记分子以及各种疾病相关蛋白质的表达。观察海藻糖对各类细胞的过表达蛋白质是否有促进清除的作用。并应用自噬通路的特异性阻断剂3-MA和wortmannin来进一步验证海藻糖的促蛋白质降解作用机制是否在自噬通路上。应用自噬通路中自噬体和溶酶体的融合的阻断剂bafilomycin A1来明确海藻糖的对LC3-II的上调作用机制。免疫印迹的方法和流式细胞检测方法检测凋亡相关蛋白质caspase-3和胞浆CytC的蛋白表达水平及ROS的水平。结果：海藻糖能上调NSC-34细胞自噬，使自噬标记分子LC3-II的表达水平明显上调（P<0.05），自噬流的标记分子P62的表达水平明显下降（P<0.05），而且这一促进自噬的作用是呈剂量依赖性的，25mM时就有轻微的促进自噬的作用，100mM的剂量下促进自噬的作用最强，能使LC3-II的表达含量最高，与之相应的，100mM海藻糖降解疾病相关毒性蛋白质的效果也最好。海藻糖可以促进TDP-43蛋白质两种突变形式及两种截短形式TDP-25和TDP-35的降解（P<0.05），对野生型TDP-43的降解无明显作用(P>0.05)。海藻糖可以促进野生型及突变型SOD1蛋白质的降解（P<0.05）。自噬阻断剂3-MA和wortmannin均可以阻断海藻糖上调LC3-II的作用（P<0.05），同时可以阻断其降解TDP-25截短片段的作用(P<0.05)。在自噬阻断剂bafilomycin A1的干预下，海藻糖可以进一步上调LC3-II的表达（P<0.05）。海藻糖可以减少TDP-25毒性片段带来的细胞凋亡相关蛋白质active caspase-3和胞浆CytC的表达（P<0.05）。海藻糖可以减轻TDP-25毒性片段所致的细胞ROS的产生（P<0.05）。结论：1海藻糖能诱导过表达人野生型TDP-43，Q331K TDP-43，M337VTDP-43突变型以及TDP-25，TDP-35两种毒性截短片段的NSC-34细胞自噬。其作用有剂量依赖性，100mM用量促进自噬作用最强。2海藻糖上调LC3-II的表达是因为其增加了自噬体生成而非阻断了自噬体和溶酶体的融合。3海藻糖能够促进Q331K TDP-43，M337V TDP-43两种突变型以及两种毒性截短片段TDP-25，TDP-35的降解，对野生型TDP-43无明显降解作用。4海藻糖能使减少TDP-25毒性片段所致的细胞凋亡损伤及线粒体损伤。第二部分：海藻糖对ALS转基因小鼠突变SOD1的自噬性降解及炎症反应的干预研究目的：本实验中，我们应用肌萎缩侧索硬化转基因G93A-SOD1小鼠及其同窝非转基因小鼠为动物模型，给予其2%海藻糖短期干预一个月，观察海藻糖能否对小鼠的自噬相关生化指标产生影响。为下一步长期用药对生存期观察实验提供体内实验依据。方法：本实验以肌萎缩侧索硬化转基因G93A-SOD1小鼠为动物模型，应用美国Jackson实验室提供的引物序列和鉴定方法对转基因G93A-SOD1小鼠进行PCR鉴定并观察过表达人突变型转基因G93A-SOD1小鼠的表型特征。免疫印迹法检测自噬的标记分子LC3-II及P62的表达以及小鼠腰髓人突变型SOD1蛋白质的表达变化。免疫荧光染色及免疫印迹法检测海藻糖对转基因G93A-SOD1小鼠脊髓前角小胶质细胞和星形胶质细胞的激活有何影响。结果：海藻糖干预组的转基因G93A-SOD1小鼠腰髓LC3-II表达含量明显升高（P<0.05），自噬流的标记分子P62表达明显下降（P<0.05）。给予海藻糖的转基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突变SOD1蛋白的表达明显下降（P<0.05）。给予海藻糖后小胶质细胞的标记物CD11B和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表达含量明显降低(P<0.05）。免疫荧光染色显示对照组转基因G93A-SOD1小鼠腰髓小胶质细胞Iba1和星形胶质细胞GFAP免疫阳性较非转基因小鼠明显增强，胶质细胞数量增多，细胞胞体增大，突起增粗增多。提示胶质细胞处于激活增生状态。而给予海藻糖干预的转基因G93A-SOD1小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞增生的状态被明显抑制。结论：1海藻糖能上调转基因G93A-SOD1小鼠脊髓组织中的自噬通路。2海藻糖能够促进转基因G93A-SOD1小鼠腰髓中突变SOD1蛋白质的清除。3海藻糖能够减轻转基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的小胶质细胞和星形胶质细胞增生活化。第三部分：海藻糖对ALS转基因小鼠病程进展及行为学的干预研究目的：本研究中，应用肌萎缩侧索硬化转基因G93A-SOD1小鼠及其同窝非转基因小鼠为动物模型，观察海藻糖对小鼠ALS疾病进程和运动功能的改善作用，并对其作用机制进行初步探讨。方法：本实验应用肌萎缩侧索硬化转基因G93A-SOD1雌鼠及其同窝非转基因小鼠为动物模型，长期应用2%海藻糖至小鼠疾病终末期。观察长期应用海藻糖对小鼠体重，神经功能评分有无影响。并联合转棒实验及吊笼实验评价长期应用海藻糖对小鼠运动功能的影响。用免疫印迹法检测终末期小鼠腰髓自噬相关标记分子LC3-II、P62以及人突变型SOD1的表达变化。用免疫荧光染色和免疫印迹法检测海藻糖对终末期小鼠腰髓中小胶质细胞和星形胶质细胞增生情况的影响。用免疫组织化学法NeuN标记神经元，计数终末期转基因G93A-SOD1小鼠腰髓前角运动神经元的数量。结果：海藻糖应用2个月余对转基因G93A-SOD1小鼠及其同窝非转基因小鼠的体重有较轻微的减轻作用，这种减轻作用在绝大多数时间点无统计学意义。应用海藻糖后，小鼠发病（即神经功能评分1）的时间推迟了4天（对照组94.43±1.53天；海藻糖干预组98.71±1.46天；P<0.05），达到评分2的时间推迟了6天(对照组111.57±2.22天；海藻糖干预组，117.93±2.43天；P<0.05)，两组比较有统计学差异。小鼠达到评分3及疾病终末期的时间（即达到神经功能评分4）也分别的推迟了5天和3天(达到神经评分3：对照组，126.0±2.84天；海藻糖干预组，131.5±2.6天；P>0.05，达到疾病终末：对照组，130.93±2.81天；海藻糖干预组，138.21±3.32天；P>0.05)，但差异尚未达到统计学意义。小鼠转棒实验在即第12周至15周（相当于神经评分1分至2分期间），尤其是在第98天给药组小鼠能力明显好于对照组（P<0.05）。转基因G93A-SOD1小鼠在第14周至16周（相当于神经功能评分4分至2分期间）的吊笼运动功能，尤其是98天、102天、112天给药组小鼠转棒运动能力明显好于对照组(P<0.05)。海藻糖可以显著提高终末期转基因G93A-SOD1小鼠脊髓LC3-II的表达水平(P<0.05)，但不能降低P62及人突变型SOD1的表达水平（P>0.05）。免疫组织化学NeuN染色显示海藻糖干预组和对照组。转基因G93A-SOD1小鼠腰髓前脚运动神经元数量无明显差异（P>0.05）。小胶质细胞和星形胶质细胞的免疫荧光染色及免疫印迹法结果显示海藻糖能明显减轻终末期转基因G93A-SOD1小鼠腰髓胶质细胞增生活化的程度。结论：1海藻糖可以延迟转基因G93A-SOD1小鼠的发病，推迟其病情进展到神经功能评分2阶段。但不能延迟转基因G93A-SOD1小鼠病情进展到神经功能评分3阶段，不能延长小鼠的生存期。2海藻糖可以在转基因G93A-SOD1小鼠病程早期改善小鼠的运动功能，但这种改善作用随着病程的进展逐渐减弱。3海藻糖可以促进终末期转基因G93A-SOD1小鼠腰髓中自噬体的生产，但不能有效降解突变的SOD1蛋白质。4海藻糖能减轻终末期转基因G93A-SOD1小鼠腰髓中的胶质细胞增生。5海藻糖不能减轻终末期转基因G93A-SOD1小鼠腰髓前脚运动神经元的丢失。