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拟穴青蟹Scylla paramamosain(Estampador，1949)是我国东南沿海4种青蟹中的主要优势种，重要的海洋经济蟹类之一。本研究采用分子生物学和免疫学技术对拟穴青蟹的一些功能蛋白—热休克蛋白70(heat shock protein70，HSP70)、蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)和促性腺激素释放激素受体(gonadotropin—releasing hormone receptor，GnRH—R)进行研究，旨在证明这些蛋白在拟穴青蟹体内的存在，了解其分子结构和分布，为拟穴青蟹生殖调控机制的研究以及水产养殖的发展提供基础资料。所涉及的研究内容可分为以下两个部分：
第一部分拟穴青蟹分子伴侣和折叠酶的分子克隆和表达的研究
运用分子生物学技术，对分子伴侣中最保守的成员—HSP70以及迄今发现的两种折叠酶之一—PDI进行研究，结果如下：
1、获得拟穴青蟹HSP70和PDI全长cDNA序列
利用cDNA末端快速扩增(RACE)和基因克隆等分子生物学技术，首次在青蟹属发现HSP70和PDI，并测定了拟穴青蟹HSP70和PDI全长cDNA序列，推导出其氨基酸序列，结果已登录GeneBank，登录号为EU754021和EU679503。
拟穴青蟹HSP70 cDNA序列全长共2，189 bp，包括完整的5’非翻译区、开放阅读框以及3’非翻译区。其中开放阅读框位于111-2，063 bp区域，共编码650个氨基酸，总分子量约为71.2 kDa，理论等电点为5.38。
拟穴青蟹PDI cDNA序列全长2，004 bp，包括完整的5’非翻译区、开放阅读框以及3’非翻译区，其中开放阅读框位于97—1，549 bp区域，推导出前体肽含有483个氨基酸，由最前端19个氨基酸的信号肽和余下的464个氨基酸的成熟肽组成。拟穴青蟹PDI成熟肽总分子量约为51.9 kDa，理论等电点为5.24。
2、拟穴青蟹HSP70和PDI与同源蛋白的比较
拟穴青蟹HSP70序列与果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、家鼠和人的相似性分别为83.1％、82.3％、86.4％、81.1％和81.2％，可见HSP70基因具有很高的遗传保守性，由HSP70氨基酸序列绘制的甲壳纲分子系统树基本能够反映出各物种间进化关系。而PDI基因的遗传保守性不高，它与果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、家鼠和人的相似率分别为(27.6％、31.0％、28.9％、29.8％和25.8％)，根据PDI氨基酸序列绘制的节肢动物门分子系统树不能反映物种间的亲缘关系。
3、HSP70和PDI在拟穴青蟹各组织器官的表达
运用半定量RT-PCR技术，分别检测了发育期雌性拟穴青蟹的八个不同组织器官--脑、胸神经团、眼柄、卵巢、肝胰腺、心脏、肌肉和胃中HSP70和PDI的转录表达情况。结果显示：在这八个组织器官中均成功扩增得到HSP70和PDI预期产物，说明这两个基因可以在拟穴青蟹组成型表达。其中，HSP70在卵巢中表达量最高，为β-Actin表达量的1.86倍，其次为脑，表达量为β-Actin的1.56倍。在眼柄和肌肉组织中的表达量最低约为β-Actin基因的一半。PDI亦在卵巢中表达量最高，为β-Actin表达量的1.06倍，在胃和眼柄表达量最低，仅为为β-Actin表达量的1/5左右。
HSP70和PDI在拟穴青蟹卵巢中以及HSP70在脑中的高表达量暗示了这两种蛋白也许与拟穴青蟹的生殖发育有关。
第二部分拟穴青蟹GnRH-R的初步研究
利用免疫印迹(Western blot)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)等技术研究了拟穴青蟹与外源促性腺激素释放激素受体的抗体结合的抗原及其相互作用的蛋白，结果如下：
1、三种GnRH-R抗体在拟穴青蟹神经生殖系统中的Western blot检测
用兔抗人、兔抗果蝇和兔抗海鞘的GnRH-R抗体分别对拟穴青蟹脑、胸神经团、眼柄和精巢进行Western blot检测。结果显示在各组织器官中共有的免疫阳性条带在分子量45-55 kDa范围之间。除眼柄外其它组织器官免疫结果还有其它免疫阳性条带的存在：脑和胸神经团中另有一条36 kDa左右带；在性腺中的不同抗体免疫结果有一定的差异，其中兔抗人和果蝇抗体免疫结果有一条28 kDa左右条带，而兔抗海鞘抗体免疫结果显示性腺中不仅有28 kDa的条带还有跟脑与胸神经团一致的约为36 kDa的条带以及一条30 kDa的条带。
2、外源GnRH-R抗体对拟穴青蟹胸神经团和性腺的免疫共沉淀反应
利用免疫共沉淀技术，分离出拟穴青蟹与外源GnRH-R抗体结合的两种抗原，为拟穴青蟹GnRH-R的存在提供证据。有趣的是这两种抗原的分子量分别与哺乳动物和非哺乳动物GnRH-R的分子量大小接近，分别为38.1 kDa和54.0 kDa。同时还分离出与这两种蛋白相互作用的八种蛋白。对这十种蛋白样品进行质谱分析，并与GPS(Applied Biosystems)-MASCOT(Matrix Science)数据库中已有的结果进行比对，没有发现匹配的、与GnRH-R相关的蛋白。