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牛黄上清丸由人工牛黄、栀子、大黄等19味药材组成,具清热泻火、散风止痛的功效,为中医临床治疗实热证“上焦”之火的常用代表性方剂。作为大复方,其药效物质解析难度大,也制约着相关基础研究及药品质量控制。本研究以牛黄上清丸为对象,采用基于中医舌诊的实热证小鼠模型、基于微量热法的抗肺炎链球菌活性筛选模型,对牛黄上清丸治疗“上焦”之火的有效部位进行筛选;利用全二维液相色谱(LC×LC)技术建立其有效部位的多维指纹图谱,结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法(OPLS)和正交偏最小二乘判别分析(OPLSDA)等化学计量学手段,对牛黄上清丸抗肺炎链球菌的活性部位进行多维谱-效关系分析,以确定抗菌的活性峰群,并采用MS方法对活性峰群进行鉴别;以探索建立中药复方药效物质分析的方法,并阐明牛黄上清丸治疗实热证的药效物质基础。主要研究结果如下:1.将牛黄上清丸(自制牛黄上清丸粉末)按极性分离成5%、30%、60%、95%乙醇部位,经超高效液相色谱(UPLC)分析表明各部位的色谱峰重叠较少。采用以中医舌诊为观察指标的实热证小鼠模型对各部进行筛选,结果表明,30%乙醇部位为牛黄上清丸治疗实热证的药效部位。2.将市售10批次牛黄上清丸按上述方法获取四个部位,采用基于微量热法的抗肺炎链球菌的试验对各部位进行筛选,结果表明,牛黄上清丸不同部位均有不同程度的抑菌作用,以60%乙醇部位相对更强。进一步对10批次牛黄上清丸60%乙醇部位样品的抑菌作用分析表明,其抑菌强度为S7>S9>S10>S6>S8>S4>S2>S1>S3>S5。3.建立了基于LC×LC的三维指纹图谱的方法,其分离能力明显优于传统的一维液相色谱方法,峰容量显著提高。并分别获得自制牛黄上清丸粉末30%乙醇部位、市售10批次牛黄上清丸60%乙醇部位的三维指纹图谱。通过对比10批次牛黄上清丸60%乙醇部位的全二维等高线图、各色谱峰保留时间及紫外吸收特征,确定了17个共有峰(X1-X17)。4.采用PCA、OPLS、OPLS-DA等化学计量学方法对10批次牛黄上清丸60%乙醇部位的三维指纹图谱与抗菌活性数据的谱-效关系分析,结果表明,化合物X17、X14、X15和X10为抑菌主要活性峰群。对活性峰群采用LC×LC-TripleQuadrupole-MS与UPLC-Q-TOF-MS分析,并通过对照品验证,鉴定了其中的3个化学成分:黄芩素(X10)、汉黄芩素(X14)、甘草酸(X15)。结论:牛黄上清丸30%、60%乙醇洗脱部位分别为其清“上焦”之火(实热证小鼠模型)和抗肺炎链球菌(微量热法)的有效部位。其中,60%乙醇部位中的化合物X17(未知)、汉黄芩素(X14)、甘草酸(X15)、黄芩素(X10)可能是牛黄上清丸抑制肺炎链球菌生长的主要活性成分。基于LC×LC技术建立的三维指纹图谱的分离能力显著优于传统的一维液相色谱,结合PCA、OPLS、OPLS-DA等化学计量学方法及成分解析,可用于中药复方药效成分的快速筛选鉴定。