论文部分内容阅读
第一部分血管内皮生长因子（VEGF）对肾小管上皮-间充质细胞转化的作用及其与BMP-7、Id变化的关系目的肾小管上皮细胞-间充质转化（epithelial-myofibroblast transition,EMT）是肾间质纤维化主要的细胞分子机制之一。TGF-β1是主要的致纤维化因子之一,而骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）则可维持肾小管上皮细胞功能,逆转EMT。TGF-β1致鼠乳腺上皮细胞分化抑制因子（inhibitor of DNAbinding/differentiation,Id）表达的下调,可能是诱导其发生EMT的机制之一。而BMP-7可上调Id表达,逆转晶状体上皮发生的EMT。血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）是调节血管发生的基本生长因子,其对肾小管上皮细胞表型具有保护作用,但机制尚不明确。本研究探讨VEGF对肾小管上皮EMT的作用及其与BMP-7、Id2及Id3变化的关系。方法实验一观察不同浓度的VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）发生EMT的影响及BMP-7、Id的变化,分组为:（1）正常对照组;（2）TGF-β1（5ng/ml）阳性对照组;（3）TGF-β1+VEGF165共同作用组:TGF-β1（5ng/ml）与不同剂量VEGF165（0.1、1、10、100ng/ml）共同作用,各组作用时间均为48h,免疫组化双染方法检测各组HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达情况,Western Blot法检测各组细胞α-SMA、BMP-7、Id2及Id3蛋白水平。实验二分别观察VEGF、VEGFR1抗体对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）发生EMT的影响及BMP-7、Id的变化,分组为:（1）正常对照组;（2）TGF-β1（5ng/ml）阳性对照组;（3）VEGF165（100ng/ml）作用组;（4）VEGFR1抗体（10μg/ml）作用组;（5）TGF-β1（5ng/ml）+VEGF165（100ng/ml）共同作用组;（6）TGF-β1（5ng/ml）+VEGFR1抗体（10μg/ml）共同作用组,各组作用时间均为48h,免疫组化双染方法检测各组HK-2细胞α-SMA、E-cadherin表达情况,Real-time PCR法、Western Blot法检测各组细胞α-SMA、BMP-7、Id2、Id3mRNA及蛋白水平。实验三观察中和内源性的BMP-7后,VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）发生EMT影响的变化及Id2的变化,HK-2细胞分组为:（1）正常对照组;（2）TGF-β1（5ng/ml）阳性对照组;（3）VEGF165（100ng/ml）作用组;（4）Alk6/Fc chimera（2ug/ml）作用组:Alk6/Fc chimera可与内源性BMP-7结合从而抑制其活性;（5）TGF-β1（5ng/ml）+VEGF165（100ng/ml）共同作用组;（6）TGF-β1（5ng/ml）+Alk6/Fc chimera（2ug/ml）共同作用组;（7）VEGF165（100ng/ml）+Alk6/Fc chimera（2ug/ml）共同作用组;（8）TGF-β1（5ng/ml）+VEGF165（100ng/ml）+Alk6/Fc chimera（2ug/ml）共同作用组,各组作用时间均为48h,Western Blot法检测细胞α-SMA、Id2水平。结果免疫组化双染、Real-time PCR、Western Blot方法均显示,TGF-β1阳性对照组较正常对照组α-SMA mRNA及蛋白表达水平显著增强（P＜0.05）,而E-cadherin表达显著减弱,BMP-7、Id2及Id3mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。TGF-β1+VEGF165（10、100ng/ml）共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,而E-cadherin表达则有部分恢复,BMP-7及Id2蛋白水平显著升高（P＜0.05）,Id3蛋白水平无显著变化。VEGF165以浓度依赖方式增强HK-2细胞BMP-7及Id2蛋白表达。TGF-β1+VEGFR1抗体（10μg/ml）共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA mRNA及蛋白表达水平进一步增强（P＜0.05）,而E-cadherin表达则几乎消失,BMP-7、Id2 mRNA及蛋白表达水平进一步降低（P＜0.05）,Id3 mRNA及蛋白表达水平无显著变化。TGF-β1+VEGF165（100ng/ml）+Alk6/Fc chimera（2ug/ml）共同作用组同TGF-β1+VEGF165（100ng/ml）共同作用组比较,α-SMA蛋白表达增强（P＜0.05）,而Id2蛋白表达无显著变化。结论VEGF165可抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生的EMT,其机制可能与BMP-7和Id2表达的上调有关,而与Id3的表达变化无关;且VEGF165可能具有直接的上调Id2表达的作用,而与BMP-7变化无关。第二部分血管内皮生长因子（VEGF）对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化过程中Smad2、Smad3途径的影响目的血管内皮生长因子（VEGF）对维持血管内皮细胞生存、再生及其功能稳定发挥关键作用。TGF-β1通过Smads信号转导途径参与调节肾小管上皮细胞转化,其中Smad2、Smad3的磷酸化是关键步骤。研究表明,VEGF可下调TGF-β刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）Smad2/3的磷酸化水平,发挥抑制TGF-β的作用,但对肾小管上皮细胞Smads作用如何尚不清楚。本研究探讨VEGF在TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT的过程中对Smad2、Smad3途径的影响。方法分两个步骤进行:实验一观察不同浓度的VEGF对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）发生EMT的影响及Smad2/3磷酸化水平的变化,分组为:（1）正常对照组;（2）TGF-β1（5ng/ml）阳性对照组;（3）TGF-β1+VEGF165共同作用组:TGF-β1（5ng/ml）与不同剂量VEGF165（0.1、1、10、100ng/ml）共同作用,各组作用时间均为48h,Western Blot法检测各组细胞α-SMA、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。实验二分别观察VEGF、VEGFR1抗体对TGF-β1诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）发生EMT的影响及Smad2/3磷酸化水平的变化,分组为:（1）正常对照组;（2）TGF-β1（5ng/ml）阳性对照组;（3）VEGF165（100ng/ml）作用组;（4）VEGFR1抗体（10μg/ml）作用组;（5）TGF-β1（5ng/ml）+VEGF165（100ng/ml）共同作用组;（6）TGF-β1（5ng/ml）+VEGFR1抗体（10μg/ml）共同作用组,各组作用时间均为48h,Real-time PCR方法检测HK-2细胞α-SMAmRNA表达情况,Western Blot法检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3蛋白水平。结果实验一Western Blot方法显示,TGF-β1阳性对照组HK-2细胞较正常对照组α-SMA蛋白表达水平显著增强（P＜0.05）,同时细胞（p-Smad2/3）/（Smad2/3）二者比值即Smad2/3磷酸化水平升高（P＜0.05）;TGF-β1与不同浓度VEGF165（0.1、1、10、100ng/ml）共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA蛋白表达水平及（p-Smad2/3）/（Smad2/3）二者比值即Smad2/3磷酸化水平呈下降趋势,表现为剂量依赖性,较高浓度的VEGF165（10、100ng/ml）共同处理组有显著性差异（P＜0.05）。实验二Real-time PCR方法及Western Blot方法显示,TGF-β1与VEGFR1抗体（10μg/ml）共同作用组同TGF-β1阳性对照组相比,α-SMAmRNA表达水平进一步增强（P＜0.05）,同时细胞（p-Smad2/3）/（Smad2/3）二者比值即Smad2/3磷酸化水平进一步升高（P＜0.05）。结论VEGF165可呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生的EMT,其机制可能与磷酸化的Smad2/3表达下调有关。第三部分麦考酚酸酯对大鼠肾间质纤维化和肾小管上皮-间充质转化的作用及机制探讨目的麦考酚酸酯（Mycophenolate mofetil,MMF）是一种免疫抑制剂,其代谢产物麦考酚酸可高度选择性、非竞争性、可逆性地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶（IMPDH）。MMF主要用于治疗免疫性疾病,近年实验研究表明,MMF具有抗纤维化的作用,但其机制尚不明确。本研究探讨MMF对腺嘌呤致大鼠慢性肾衰模型的肾间质纤维化及肾小管上皮-间充质转化（EMT）的作用,以及该作用同肾组织血管内皮生长因子（VEGF）及分化抑制因子（Id2、Id3）变化的关系。方法雄性Wistar大鼠64只,分为3组:1、正常组（n=16）;2、慢性肾衰（CRF）模型组（n=24）:腺嘌呤125mg·kg-1·d-1灌胃;3、MMF治疗组（n=24）:腺嘌呤125mg·kg-1·d-1+MMF15mg·kg-1·d-1灌胃。分别于第2、4、6、8周处死动物,处死前1天留取24小时尿,检测尿蛋白。处死前心脏取血,生化自动分析仪检测血肌酐值。同时留取肾组织,HE和Masson染色行肾间质纤维化程度评分;免疫组化法检测肾组织α-SMA、TGF-β1表达情况;RT-PCR方法检测肾组织TGF-β1、VEGFmRNA水平的表达情况;Western Blot方法检测肾组织α-SMA、VEGF、Id2、Id3蛋白水平的表达情况。结果随腺嘌呤给药时间延长,MMF治疗组与CRF模型组血肌酐逐渐升高,与正常组比较差异显著（P＜0.01）,但MMF治疗与CRF两组间无显著性差异（P＞0.05）。MMF治疗组在第6、8周,24小时尿蛋白水平较CRF模型组下降（P＜0.01）。同正常组比较,CRF模型组与MMF治疗组在第6、8周肾间质纤维化程度明显加重（P＜0.01）,且MMF治疗组肾间质纤维化程度较CRF模型组均减轻（P＜0.01）。同正常组比较,CRF模型组及MMF治疗组肾组织α-SMA表达水平在第6、8周明显增强（P＜0.01）,且MMF治疗组肾组织α-SMA表达水平较CRF模型组降低（P＜0.01）。同正常组比较,CRF模型组及MMF治疗组肾组织TGF-β1表达增加（P＜0.05）,MMF治疗组较CRF模型组降低,在第2、4、6周有显著差异（P＜0.01）。同正常组比较,在第8周CRF模型组肾组织VEGF蛋白表达下降（P＜0.01）,MMF治疗组肾组织VEGF表达在第6、第8周显著高于CRF模型组（P＜0.01）。MMF治疗组肾组织Id2、Id3表达较CRF模型组增强,在第4、6周差异显著（P＜0.05）。结论在腺嘌呤致大鼠慢性肾衰模型中,麦考酚酯酸具有减轻肾间质纤维化的作用,该作用可能与抑制肾小管上皮细胞转分化、肾组织TGF-β1表达的下调及VEGF、Id2、Id3表达的上调有关,其确切机制需进一步探讨。