论文部分内容阅读
蓝舌病毒（Bluetongue Virus，BTV）是呼肠孤病毒科环状病毒属的成员，由昆虫传播，感染牛、羊等野生反刍动物。该病毒全世界己发现25个血清型，给畜牧业造成了严重的经济损失。BTV含10分子的双链RNA（dsRNA）作基因组，分别编码病毒7个结构多肽（VP1，VP2，VP3，VP4，VP5，VP6，VP7）和3个非结构蛋白多肽（NS1，NS2，NS3）。外衣壳由两种主要多肽VP2和VP5构成，内衣壳主要由VP3和VP7两种多肽构成，同时内衣壳包绕三种少量蛋白VP1、VP4和VP6以及基因组。VP7蛋白携带有群特异性抗原决定簇，在病毒装配中起重要作用，占衣壳蛋白组成的36％。由该病毒群特异性抗原决定簇产生的抗体多数是针对VP7的，且S7基因非常保守，是BTV新型疫苗的主要研究对象。VP2蛋白是蓝舌病毒的主要结构多肽，含有型特异性抗原决定簇，诱导机体产生中和抗体。 蓝舌病毒BTV-HbC3株是我们实验室于1994年在襄樊某畜牧场所分离到的一株病毒。本研究通过对BTV-10型和BTV-HbC3的增殖特征、免疫学特征、形态学特征以及分子生物学方面的比较进一步证实了BTV-HbC3是一株蓝舌病毒，并且可能是一株新的基因型毒株。 1、蓝舌病毒BTV-HbC3在Vero、MCF-7和Hep-3B细胞上的增殖特点以及与BTV-10的免疫学关系。发现BTV-HbC3株和BTV-10株感染细胞后在48hr之内均出现CPE，表现为细胞收缩变圆、间隔变大等特征。通过琼脂糖双向扩散实验显示BTV-HbC3和BTV-10型编码共同抗原。 2、根据已发表的BTV-10标准株S7基因序列，通过Primer Premier 5.0软件设计合成一对覆盖BTV-10 S7片段13.303bp之间区段的引物，经逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出蓝舌病毒BTV-HbC3株和BTV-10型的S7基因5′非编码区（NonCoding Region，NCR）cDNA片段，以建立起dsRNA体外扩增系统。将扩增的BTV-HbC3毒株的S7基因5′非编码区片段通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中，用PCR技术和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pUCm-T-BTV-HbC3-S7。在ABI PRISM377全自动序列分析仪上测序得到蓝舌病毒BTV-HbC3株和BTV-10型S7片段5‘一NCR区域分别长为277bp和290bp的产物。通过Blast软件将两株病毒核昔酸序列在GenBank上比对发现，BTV一HbC3株57基因5‘非编码区与呼肠孤病毒一3（Reovirus一3）型LZ片段3464bp一3739bp序列相同;然而就这一段序列比较而言，BTV一HbC3株和BTV一10型之间并无同源。也许BTV一HbC3和BTV一10起源于两个基因群，或是在双链RNA病毒中RNA多聚酶缺乏严格的校正活性以及在进化过程中与呼肠孤病毒一3发生基因重配（reassortment）插入了一段呼肠孤病毒一3的序列使然。 3、MTT法确证了BTV一HbC3株和BTV一10型对乳腺癌细胞MCF一7有较强的抗增殖作用;将两株病毒分别以1 MOI接种MCF一7细胞，通过流式细胞术检测凋亡率分别为31.9%和29.1%。结果表明BTV一HbC3株和BTV一10型体外可以杀乳腺癌MCF一7细胞。 结论:通过病毒与细胞相互作用的生物学特征、病毒分子生物学和免疫学特征等进行系统研究，揭示出:BTV一HbC3与BTV一10能够感染肿瘤细胞，并且表现出基本相同的细胞生物学特征和形态学特征;BTV一HbC3和BTV一10型编码共同抗原，由于VP7是BTV的群特异性抗原，我们认为二者的共同抗原为VP7;利用BTV一10 57片段5‘非编码区13一3O3bp区段设计的一对特异性引物能有效地扩增合成BTV一HbC3 277bp大小特异性片段，所扩增片段大小与BTV一10并不相同;序列分析表明BTV一HbC3株s7基因的5‘一NcR 277bp核昔酸与呼肠孤病毒一3 LZ基因3464一3739bP序列相同，替换了BTV的57片段s‘一CR 13一303bp长为29obp的序列。这些结果表明BTV一HbC3株是蓝舌病毒，并有可能是一种新的基因型蓝舌病毒。