论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis,GPS）常在猪场中引起副猪嗜血杆菌病。副猪嗜血杆菌为全世界危害养殖业主要细菌之一,表现症状为高热、呼吸困难、腹膜炎、心包炎和脑膜炎。在全球饲料中禁抗趋势下,且疫苗效果不稳定,亟待寻找一种新的抗生素替代物。副猪嗜血杆菌可以引起血管损伤和炎症,但目前血管损伤机制尚不完全清楚。lncRNAs（long non-coding RNA）和miRNAs（micro RNA）能调节炎症免疫反应已有报道。黄芩苷为黄芩主要活性成分,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、治疗及预防糖尿病、保护心脑血管和神经、保护肝脏、增强免疫及抑制变态反应等作用。因此,本试验研究GPS感染猪血管内皮细胞后对lncRNAs和miRNAs表达的影响,并研究黄芩苷对lncRNAs和miRNAs表达的调节作用。通过高通量测序,发现黄芩苷可以调节副猪嗜血杆菌感染后lncRNAs和miRNAs表达,从而抑制血管炎症。1.黄芩苷对副猪嗜血杆菌诱导猪血管内皮细胞的转录组和lncRNA表达的影响试验设置3个组:空白对照组、GPS模型组、GPS+黄芩苷药物处理组。每组3个重复。分离原代血管内皮细胞,用10%胎牛血清M-199无双抗培养基重悬计数、稀释,使体系内细胞浓度为1×106个/m L,每个重复加入1 m L细胞悬液,1 m L无双抗培养基,黄芩苷处理组中加入500μg/m L黄芩苷0.25 m L。预处理1 h后,黄芩苷组,GPS模型组加入稀释到4×106 CFU/m L的对数期的副猪嗜血杆菌0.25 m L,空白组对照组用培养基补齐至2.5 m L,共培养12 h后,收集细胞,提取RNA,用Illumina Hiseq 2000平台进行测序。转录组结果表明,副猪嗜血杆菌刺激血管内皮细胞后,4067个基因差异表达（Fold change>2,P<0.05）,其中1499个基因表达上调,2568个基因表达下调。KEGG分析显示差异基因主要富集在Toll样通路和肿瘤坏死因子通路。与副猪嗜血杆菌感染组相比,黄芩苷处理后,492个基因差异表达（Fold change>2,P<0.05）,其中260个基因上调,232个基因下调;KEGG分析,富集的通路主要集中在细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路等。通过PPI图进行分析,发现TLR2、CCL5、CXR4、CD40等基因位于蛋白质-蛋白质相互作用枢纽中心。对PPI网络中连接程度最高的30个基因进行KEGG富集分析,发现这些基因主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路。Q-RT PCR结果显示,副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后,CCL5、GBP1、SAMHD1表达上调,而黄芩苷处理后,这些基因表达下调。因此我们推测黄芩苷可通过改变CCL5、GBP1、SAMHD1等基因的表达,抑制基因所参与的细胞因子与细胞因子受体、TNF信号通路,减轻副猪嗜血杆菌感染。lncRNA结果表明:在副猪嗜血杆菌感染后,有584个lncRNAs差异表达,其中294个lncRNAs表达上调,290个lncRNAs表达下调（Fold change>2,P<0.05）。与副猪嗜血杆菌感染组相比,经黄芩苷处理后,27个lncRNAs的表达有显著差异,其中11个lncRNAs表达上调,16个lncRNAs表达下调。本试验通过顺式与反式对lncRNA靶基因进行预测,共获得18407个靶基因,其中264个靶基因为顺式预测,18167个靶基因为反式预测。对差异lncRNAs的靶基因进行KEGG分析发现,副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后,对应靶基因主要集中参与了肿瘤坏死因子信号通路、细胞凋亡、NF-κB信号通路、N-聚糖生物合成。与副猪嗜血杆菌组相比,黄芩苷处理后,对应的靶基因主要参与了丙酸代谢、嘧啶代谢、肿瘤坏死因子信号通路。对lncRNAs与靶基因互作结果进行Q-RT PCR验证结果表明,副猪嗜血杆菌感染后,lncRNA ALDBSSCT0000001677、ALDBSSCT0000001353、MSTRG.10724.2和ALDBSSCT0000010434表达均显著上调,黄芩苷处理后,这4个lncRNAs表达均极显著下调,与测序结果一致。我们推测,黄芩苷可能通过调节lncRNA ALDBSSCT0000001677、ALDBSSCT0000001353、MSTRG.10724.2和ALDBSSCT0000010434的表达作用于GBP1、SAMHD1、CCL5等靶基因,减轻副猪嗜血杆菌感染所引起的血管炎症。2.黄芩苷对副猪嗜血杆菌诱导猪血管内皮细胞的miRNAs表达的影响按照相同实验处理,收集细胞进行miRNA表达谱分析。在3组（空白对照组、副猪嗜血杆菌感染组和黄芩苷处理组）中得到427个已知miRNAs和155个新miRNAs。副猪嗜血杆菌感染后,共22个miRNAs在血管内皮细胞中有显著差异表达。其中:19个miRNAs表达上调,3个miRNAs表达下调。其中ssc-mi R-375、ssc-mi R-155-3p和ssc-mi R-221-5p在副猪嗜血杆菌感染的血管内皮细胞中的表达水平均高于对照组。与副猪嗜血杆菌组相比,黄芩苷处理后,54个miRNAs在血管内皮细胞中显著差异表达,其中4个miRNAs表达上调,50个miRNAs表达下调。与副猪嗜血杆菌感染组相比,黄芩苷处理组ssc-mi R-375、ssc-mi R-122-5p和ssc-mi R-200b的表达水平下调幅度最大。使用mi Randa预测miRNA可能的靶基因,发现副猪嗜血杆菌感染组有5个差异表达miRNAs:ssc-mi R-221-5p、novel.114、novel.1、ssc-mi R-219a、ssc-mi R-146b,共获得5868个预测的靶基因,主要差异靶基因有:ENDPD8、COL4A2等。对差异靶基因进行KEGG分析,发现其参与的主要信号通路有:肌动蛋白细胞骨架调控、焦点黏附、ECM-受体相互作用、细菌侵袭上皮细胞、粘附连接等。黄芩苷组1个差异表达miRNA:ssc-mi R-192,获得99个预测的靶基因,主要靶基因有:EIF4E、MSN等。对miRNA的靶基因进行KEGG分析:发现靶基因参与的主要信号通路有:错配修复、过氧化物酶体、氧化磷酸化、DNA复制和ABC转运蛋白。综上所述,副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后能改变血管内皮细胞lncRNAs和miRNAs表达,黄芩苷通过调节lncRNA ALDBSSCT0000001677、ALDBSSCT0000001353、MSTRG.10724.2和ALDBSSCT0000010434等重要lncRNA的表达作用于SAMHD1、CCL5等靶基因,从而减轻副猪嗜血杆菌的影响;主要通过调节ssc-mi R-192等miRNA和靶基因EIF4E、MSN等,减轻副猪嗜血杆菌诱导的血管炎症。