研究背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位居肿瘤谱的前列。美国癌症协会统计报告显示,美国男性新增结直肠癌患者仅次于前列腺癌和肺癌;而女性新增患者仅次于乳腺癌和肺癌;其男性和女性死亡率均位于恶性肿瘤的第三位。在中国,结直肠癌的发病率及死亡率均位居第五位。而且,随着人们生活方式的改变,结直肠癌的发病率及死亡率正逐年上升。早期结直肠癌患者通过手术切除,并辅助以化疗,效果良好;但对晚期结直肠癌患者特别是已发生转移的结直肠癌患者尚缺乏有效的治疗手段,且预后很差。因此,深入研究结直肠癌发生发展的分子机制将有助于寻找结直肠癌早期诊断的新靶点,并为临床治疗提供实验依据。在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞基因表达谱发生改变,包括癌基因表达升高和抑癌基因表达降低,其中表观遗传异常是导致基因表达异常的重要原因之一。组蛋白乙酰化修饰是最为常见和重要的一种表观遗传修饰,参与染色质重塑过程和基因表达调控。该修饰是可逆的,其形成和去除是由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶.(histone deacetylase,HDAC)介导。研究发现,多种肿瘤的发生发展过程中常伴有组蛋白乙酰化修饰异常和HDAC表达异常;而一些针对HDAC的药物能有效抑制肿瘤发生发展,成为肿瘤治疗的潜在靶点。这说明,HDAC调控的组蛋白乙酰化改变异常是引起肿瘤发生发展的关键因素之一。SIRT6属于Sirtuin(SIRT)家族成员,是酵母细胞中沉默信息调节因子2(silent formation regulator 2,Sir2)同源物。该家族成员归属于第III类组蛋白去乙酰化酶,因其功能发挥依赖于NAD+而得名。人类细胞中有7个不同的Sirtuin蛋白,分别命名为SIRT1-7,无论在结构和功能上都与Sir2保持着较高的同源性。SIRT家族成员主要通过去除组蛋白乙酰化而调节靶基因转录,从而参与如神经保护、细胞衰老凋亡、糖脂类代谢、炎症氧化应激反应等多种生物学过程的调控。近来研究表明,SIRT6在多种肿瘤中扮演肿瘤抑制因子的角色。临床肿瘤学研究显示,SIRT6蛋白在肝癌、头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌等多种癌组织中低表达;细胞及动物水平研究发现,SIRT6可调节多条癌症相关通路,包括:维持基因组稳定性、抑制肿瘤细胞糖降解途径、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖,从而抑制肿瘤的发生、发展。然而,目前对SIRT6在结直肠癌中表达情况,以及SIRT6在结直肠癌细胞生物学功能方面的研究报道较少。目前认为,SIRT6蛋白主要是通过使组蛋白H3K9位点去乙酰化而调节基因转录,从而调节肿瘤发生、发展。通过调节启动子区组蛋白乙酰化水平,SIRT6可抑制抗凋亡蛋白survivin的表达,从而抑制肝癌发生;通过抑制Hifla活性,从而调节肿瘤细胞葡萄糖稳态;通过抑制糖酵解途径蛋白表达,从而抑制肿瘤细胞糖酵解通路;此外SIRT6还可抑制核糖体蛋白的表达,从而抑制蛋白质翻译和细胞增殖。然而,对结直肠癌细胞中SIRT6调控靶基因的认识还不全面。为全面明确SIRT6在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制,本学位论文首先研究SIRT6在结直肠癌中的表达情况,分析SIRT6的表达与患者的年龄、疾病分期、肿瘤分化程度等临床病理特征的相关性;随后深入研究SIRT6对结直肠癌干细胞增殖、侵袭等细胞行为学的影响;最后鉴定CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3是SIRT6的靶基因。本学位论文为结直肠癌的临床诊断、预后评价和靶向治疗提供理论依据。第一部分:SIRT6蛋白表达与结直肠癌临床病理特征相关性研究目的:检测结直肠癌和癌旁结直肠组织中的SIRT6蛋白的表达情况,分析明确其与患者年龄、疾病分期、肿瘤分化程度等临床病理特征的相关性。方法:采用免疫组织化技术检测SIRT6在62例结直肠癌及癌旁组织中的表达情况,应用SPSS统计软件分析SIRT6的表达与临床病理特征的相关性的相关性。结果:1.结直肠癌癌组织SIRT6蛋白表达水平均显著低于癌旁非肿瘤组织,差异有显著性(P<0.05)。2.结直肠癌组织SIRT6蛋白表达水平与患者的性别、年龄及其癌组织肿瘤大小等临床病理参数之间均无相关性(P>0.05)。3.SIRT6强阳性(“++”)表达率在结直肠癌AJCC临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中分别为57.1%、27.3%、11.2%、0.0%,提示SIRT6表达水平随结直肠癌AJCC临床分期等级的升高呈下降趋势,差异具有统计学意义(P=0.030)。4.SIRT6强阳性(“++”)表达率在不同结直肠癌病理分级1、2、3级中分别为50.0%、20.0%、7,2%,这提示SIRT6表达水平随结直肠癌病理分级等级的升高逐渐下降,差异具有统计学意义(P=0.009)。结论:1.与癌旁非肿瘤组织相比较,SIRT6在结直肠癌组织中低表达。2.结直肠癌SIRT6蛋白表达水平与患者的性别、年龄及其癌组织肿瘤大小等临床病理参数之间均无相关性。3.结直肠癌中SIRT6的表达与临床分期呈负相关,与病理分级呈负相关。第二部分:SIRT6对结直肠癌干细胞功能的影响目的:明确SIRT6在结直肠癌干细胞中的表达情况;明确SIRT6对结直肠癌干细胞增殖、侵袭等行为学的影响。方法:利用流式细胞仪分选结直肠癌细胞(SW480)及结直肠癌组织中肿瘤干细胞(CD133+),定量PCR法及免疫印迹法比较SIRT6在干细胞与非干细胞中的表达;在SW480肿瘤干细胞(CD133+)中高表达SIRT6蛋白,随后CCK8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期改变、检测克隆形成能力;利用基于Matrigel的Transwell法检测细胞侵袭能力。结果:1.SW480分离的CD133+细胞中SIRT6 mRNA水平和蛋白水平均显著低于CD133-细胞;肿瘤组织分离的CD133+细胞中SIRT6 mRNA水平表达降低。2.SW480干细胞中高表达SIRT6后生长显著减慢。3.SW480干细胞对照组处于G0/G1期细胞占总细胞数的31±5%,S期细胞约占49±6%,G2/M期细胞约占20±3%;高表达SIRT6后,G0/G1期细胞数目显著增加(51±6%),S期细胞数目显著减少(28±5%),与对照组相比有显著差异(P<0.0])。4.与对照组(64±8个)相比,表达SIRT6可显著降低SW480干细胞克隆形成的数目(36±8 个,P<0.01)。5.SW480干细胞中高表达SIRT6后,其迁移穿过Matrigel的细胞数为对照组的0.70±0.04 倍(P<0.01)。结论:1.SIRT6在结直肠癌肿瘤干细胞中低表达;2.SIRT6抑制SW480肿瘤干细胞增殖;3.SIRT6导致SW480肿瘤干细胞周期阻滞在G0/G1期;4.SIRT6抑制SW480肿瘤干细胞克隆形成;5.SIRT6抑制SW480肿瘤干细胞侵袭能力。第三部分:SIRT6靶基因的鉴定目的:鉴定SW480干细胞(CD133+)中SIRT6直接调控的靶基因,从而明确SIRT6调节结直肠癌干细胞行为的分子机制。方法:SW480干细胞中高表达SIRT6,RNA-seq法筛选差异表达基因,后经功能注释,最终将目标锁定在CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3四个基因上。进一步利用定量PCR、蛋白质免疫印迹等方法来研究SIRT6对CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3的调节作用;并利用染色质免疫沉淀法检测SIRT6与CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3基因启动子区的结合情况;最后利用染色质免疫沉淀法检测SIRT6对CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3基因启动子区组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)乙酰化的影响。结果:1.RNA-seq结果显示,SW480干细胞中高表达SIRT6引起806个基因表达上调和621个基因表达下调。功能通路分析发现,SIRT6调节的基因归类于代谢通路、细胞周期、结直肠癌、P53通路等生物学过程。我们最终将靶基因锁定在CDC25A、TGFB2、SMAD2和SMAD3四个基因上,其中CDC25A与细胞周期密切相关,而TGFB2、SMAD2和SMAD3是TGF-β信号通路中的关键分子。2.定量PCR的实验结果显示,SW480干细胞(CD133+)中高表达SIRT6后,CDC25A基因的mRNA水平下调至对照组的0.32±0.05倍(P<0.01),TGFB2基因的mRNA水平下调至对照组的0.58±0.08倍(P<0.01),SMAD2基因的mRNA水平下调至对照组的0.40±0.07倍(P<0.01),SMAD3基因的mRNA水平下调至对照组的0.54±0.06倍(P<0.01)。蛋白质免疫印迹实验结果显示,高表达SIRT6后CDC25A、TGFB2、SMAD2、SMAD3的蛋白水平显著下调。3.免疫沉淀得到的DNA中CDC25A基因启动子的含量为IgG组的7.28±0.49倍(P<0.01),TGFB2基因启动子的含量为IgG组的5.83±0.91倍(P<0.01),SMAD2基因启动子的含量为IgG组的6.59±0.84倍(P<0.01),SMAD3基因启动子的含量为IgG组的5.60±0.73(P<0.01)。4.高表达SIRT6后,CDC25A启动子H3K9乙酰化水平下调至对照组的0.62±0.12倍(P<0.01,图4),TGFB2启动子H3K9乙酰化水平为对照组的0.73±0.08倍(P<0.01,图4),SMAD2启动子H3K9乙酰化水平为对照组的0.68±0.07倍(P<0.01,图4),SMAD3启动子H3K9乙酰化水平为对照组的 0.72±0.09 倍(P<0.01,图 4)。结论:1.SIRT6抑制SW480干细胞中CDC25A、TGFB2、SMAD2、SMAD3基因mRNA及蛋白质表达。2.SIRT6与CDC25A、TGFB2、SMAD2、SMAD3靶基因的启动子区特异性结合。3.SIRT6 特异性抑制 CDC25A、TGFB2、SMAD2、SMAD3 基因启动子区 H3K9乙酰化水平。