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[目 的]松萝烟酰胺(C24H20N2O7)是本课题组对抗癌活性化合物松萝胺进行结构改造得到的新结构化学物。本研究对该化合物的体外抗肿瘤作用及其作用机制进行研究,了解松萝烟酰胺体外对不同人癌细胞作用及其差异,探索其体外抗肿瘤作用机制,为松萝烟酰胺后期的研发提供科研依据。[方法]1.体外抗癌的剂量-效应关系:采用MTT法检测不同浓度的松萝烟酰胺处理人癌细胞72h后的吸光度OD值,计算细胞活力抑制率和半数抑制浓度(IC50)。2.体外抗癌的时间-效应关系:采用MTT法检测不同浓度的松萝烟酰胺处理人癌细胞24、48、72h后的吸光度OD值,计算细胞在不同时间下的存活率和半数抑制浓度(IC50)。3.与临床抗癌药物DDP的联合作用:采用MTT法测定单纯给药组与联合组处理人癌细胞48h后的吸光度,计算细胞活力抑制率,根据金氏公式判断联合作用形式。4.对细胞迁移的影响:采用细胞划痕实验观察不同浓度的松萝烟酰胺处理人癌细胞12、24、36、48h后,细胞的迁移状况,计算细胞迁移率。5.对细胞周期和凋亡的影响:不同浓度的松萝烟酰胺处理人癌细胞48h后,采用CyStain DNA 1 step或AnnexinV/PI双染法,以流式细胞仪检测癌细胞的周期分布和凋亡情况,计算各组细胞G1期、S期和G2期的细胞百分率以及细胞凋亡率。采用DAPI和Hoechst荧光染色法,在倒置荧光显微镜观察药物处理后细胞形态变化,判断药物对癌细胞凋亡的影响。6.抗肿瘤作用的分子机制研究:不同浓度的松萝烟酰胺处理人癌细胞48h后,采用免疫印迹分析(Western blot)法测定Bax/Bcl-2/Caspase-9/caspase-3凋亡信号通路的 Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3 蛋白,EMT 过程相关的 Vimentin、N-cadherin、E-cadherin 蛋白,PI3K/AKT 信号通路的 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达量。采用实时荧光定量(RT-qPCR)法检测Bax、Bcl-2、caspase-9、caspase-3 蛋白 mRNA 表达水平。[结 果]1.松萝烟酰胺对多个人癌细胞株均具有显著性体外抗癌作用,其体外抗癌作用具有剂量-效应关系,不同癌细胞对其敏感性存在差异:松萝烟酰胺在0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L的浓度下对A-549细胞的增殖抑制率分别为-7.83%、-6.89%、0.24%、90.15%、92.76%,IC50为 4.12μmol/L;对 XWLC-05 细胞的增殖抑制率为 1 7.09%、27.18%、56.11%、82.44%、83.30%,IC50 为 2.16μmol/L;对 SPC-A1细胞的增殖抑制率为 11.90%、25.26%、65.69%、91.75%、95.27%,IC50 为1.90μmol/L;对 SGC-7901 细胞活力抑制率为 2.95%、27.73%、83.98%、94.92%、95.82%,IC50 为 1.62μmol/L。2.松萝烟酰胺体外抗癌作用存在时间-效应关系,SPC-A1细胞24、48、72h的IC50分别为4.67μmol/L、2.60μmol/L、1.92μmol/L,SGC-7901 细胞24、48、72h 的 IC50 分别为 3.45μmol/L、1.43μmol/L、1.22μmol/L。3.松萝烟酰胺与DDP联合用药作用:低剂量(0.625、1.25μmol/L)下,联合组对SPC-A1细胞的q值为0.59和0.66,对SGC-7901细胞的q值为0.76和0.82,具有拮抗作用。高剂量(2.5μmol/L)下,联合组对SPC-A1细胞的q值为0.86,对SGC-7901细胞的q值0.93,具有相加作用。4.松萝烟酰胺能显著性抑制癌细胞侵袭迁移,且随着药物浓度的增加和药物处理时间的延长,细胞迁移率降低:(1)SPC-Al细胞:松萝烟酰胺在0、1.25、2.5、5、10μmol/L 的浓度下 12h 的细胞迁移率分别为 29.38%、26.27%、24.57%、12.97%、16.81%,24h 细胞迁移率分别为 38.05%、29.43%、33.93%、17.21%、8.60%,36h 细胞迁移率分别为 59.50%、46.01%、41.53%、25.80%、14.53%,48h细胞迁移率分别为 70.33%、51.15%、47.54%、32.69%、21.17%;(2)SGC-7901细胞:松萝烟酰胺在0、1.25、2.5、5、10μmol/L的浓度下12h的细胞迁移率分别为 26.62%、27.02%、19.82%、6.32%、4.51%,24h 细胞迁移率分别为 39.68%、27.97%、22.32%、5.34%、9.70%,36h 细胞迁移率分别为 50.63%、36.18%、22.26%、19.81%、16.68%,48h 细胞迁移率分别为 55.69%、39.47%、26.36%、23.86%、21.84%。5.松萝烟酰胺能阻滞细胞于S期,随着药物浓度的增加,S期细胞百分率增加,G0/G1期细胞占比降低。SPC-A1细胞在0、1.25、2.5、5μmol/L的浓度的松萝烟酰胺作用下,S期百分率为26.1%、27.62%、42.93%、52.45%,G0/G1期细胞百分率为 59.86%、59.49%、49.59%、38.76%。SGC-7901 细胞在 0、1.25、2.5、5μmol/L的浓度的松萝烟酰胺作用下,S期细胞百分率为32.27%、39.13%、47.28%、54.23%,G0/G1期细胞百分率为 60.34%、45.40%、44.19%、34.29%.6.松萝烟酰胺能诱导细胞凋亡,且随着药物浓度的增加和药物作用时间的延长,细胞总凋亡率增加。SPC-A1细胞的0、1.25、2.5、5μmol/L组的总凋亡率分别为10.03%、18.37%、36.26%、39.58%,SGC-7901 细胞 0、1.25、2.5、5μmol/L组细胞凋亡率分别为6.09%、7.97%、23.53%、36.93%。荧光显微镜下见松萝烟酰胺能使癌细胞形成凋亡小体、核浓缩、核碎裂的现象。7.松萝烟酰胺能显著上调SPC-A1细胞和SGC-7901细胞的Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9 蛋白的表达,下调 Bcl-2 蛋白的表达,使Bax/Bcl-2比例增加。显著下调SPC-Al细胞的Vimentin和N-cadherin蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达。显著下调SPC-A1细胞的p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。且随着药物浓度的增加,变化趋势越明显。[结 论]1.松萝烟酰胺具有显著性体外抗癌活性,SGC-7901细胞在已检测的4个癌细胞株中对松萝烟酰胺最敏感。2.松萝烟酰胺体外抗癌作用具有剂量-效应和时间-效应关系。3.高剂量的松萝烟酰胺在体外与临床抗癌药物顺铂具有相加作用,可提高化疗药物的敏感性。4松萝烟酰胺能显著性抑制癌细胞侵袭迁移。5.松萝烟酰胺阻滞癌细胞于S期。6.松萝烟酰胺促进癌细胞凋亡。7.松萝烟酰胺抗肿瘤作用的分子机制为调控Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3信号通路诱导细胞凋亡,影响Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3的mRNA水平,同时调控PI3K/AKT信号通路抑制细胞EMT转化。