研究背景目前,联合抗逆转录病毒疗法(combined anti-retro viral therapy, cART)虽然可以有效控制HIV (human immunodeficiency virus)的感染和传播,提高HIV感染者的生活质量并延长感染者寿命,但由于治疗后HIV潜伏库的存在使得其不能从根本上治愈HIV感染。HIV潜伏库中的病毒表现为基因水平几乎无转录,蛋白水平完全不表达,因此可逃逸宿主免疫系统的识别和清除。为了克服这一障碍,一种具有较强可行性的“激活再杀灭”策略被提出。这种策略旨在通过活化储存于宿主细胞中的休眠前病毒,启动病毒的复制周期(激活)从而使得宿主细胞因病毒诱导的毒性和免疫系统的清除作用而死亡(杀灭)。基于这一策略,研究者发现了一系列潜伏感染激活剂(latency reversing agents, LRAs),根据其作用机制主要分为三大类：(1)表观修饰剂：包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACis),组蛋白甲基转移酶抑制剂(histone methyltransferase inhibitors, HMTis)和DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitors, DNMTis);(2)细胞因子调节剂：包括PKC/NF-κB通路激活剂和转录延伸因子p-TEFb (positive transcription elongation factor b)激活剂；(3)免疫调节剂：包括IL-2、IL-7、IL-15和OKT3抗体等。遗憾的是,绝大部分激活剂在临床试验中与cART联用后,并未达到清除或缩小潜伏库的目的。造成这种现象可能的原因有如下两点：(1)激活剂在体内无选择性地促进广泛T细胞活化反而使得机体内CD4+T细胞快速减少；(2)激活剂无法诱导或对CTL (cytotoxic T lymphocyte)反应产生抑制作用,致使潜伏HIV被激活后潜伏库无法被机体免疫系统及时清除。总之,目前在临床试验中被证明能达到缩小HIV潜伏库效果的药物仅有两种组蛋白去乙酰化酶抑制剂：罗米地辛(Romidepsin)和帕比司他(Panobinostat)。近年来,多个细胞因子和病毒蛋白被发现与HIV的潜伏密切相关,如HIV Tat蛋白在静息期CD4+T细胞中的缺失能抑制病毒的转录起始和延伸。这也被认为是HIV形成潜伏的原因之一。然而,针对宿主细胞和病毒分子的相互作用调控HIV整合后的潜伏或激活的研究不多。有研究通过全基因组siRNA筛选的方法得到842个与HIV感染相关的宿主基因。另有研究通过全基因组蛋白质谱分析发现HEK-293和Jurkat细胞系中的435个宿主细胞分子与HIV蛋白能产生直接的相互作用。尽管如此,目前仅有极少数细胞因子被发现能影响HIV的潜伏形成或激活,更多类似的细胞因子等待着被发掘。研究目的近年来,研究人员发现多种参与HIV潜伏形成、维持和激活的细胞因子。其中宿主细胞中的关键转录因子NF-κB与分子伴侣HSP90(heat shock protein 90)能调控HIV潜伏激活。此外,HSP40(heat shock protein 40)和HSP70(heat shock protein 70)也分别与病毒蛋白Nef和Tat产生直接的相互作用。众所周知,热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)作为分子伴侣广泛地参与应激反应下细胞内环境的蛋白稳态过程,而热休克蛋白的转录因子HSF1(heat shock factor 1)也被报道广泛参与这一过程。因此,我们推测HSF1可能直接参与HIV的潜伏激活。而HSF1被证明可结合于HIV转录调控区5’-LTR(long terminal repeat),并积极地参与HIV的生命活动,这进一步印证了上述假说。本研究拟深入揭示转录因子HSF1调控潜伏HIV激活的分子机制,同时以HSF1介导的应激反应诱导潜伏HIV活化为重点研究对象,探讨HSF1活化形式参与HIV潜伏激活的调控机理。在此基础上,充分探索HSF1作为潜伏HIV激活靶点的可能性,为HIV治愈的研究及治疗提供新的思路。研究方法1.流式细胞术(FCM)J-lat 10.6细胞是HIV经典的潜伏细胞模型之一,因其潜伏的HIV基因组中包含有GFP报告基因而广泛用于HIV潜伏激活剂筛选。本文采用J-lat 10.6细胞系作为主要实验对象。研究使用多种应激反应诱导剂包括Salubrinal和Carfilzomib刺激J-lat 10.6细胞,随后采用流式细胞仪检测J-lat 10.6细胞的阳性GFP%,以此来评估激活剂的激活活性。同样地,我们采用细胞信号通路或细胞内调控因子抑制剂或激动剂与文中发现的激活剂来共同处理J-lat 10.6细胞,运用FCM检测处理后J-lat 10.6细胞的阳性GFP%,以此来检测信号通路中细胞因子(p300、p-TEb、HSP90等)的参与作用。此外,我们采用激活剂处理人PBMCs (peripheral blood mononuclear cells),通过对T细胞表面活化标志物CD25和CD69染色,随后运用FCM检测细胞表面标志物的表达,以此来评价激活剂对T细胞活化程度的影响。2.细胞毒性试验本文采用CCK-8法检测激活剂或与抑制剂共处理J-lat 10.6、U1、ACH2. PBMCs等细胞时化合物对于细胞存活率的影响,为客观判断激活剂或抑制剂对潜伏HIV活化的影响提供依据。3.蛋白质免疫印迹(WB)研究通过核质分离方法提取Salubrinal, Bortezomib和Carfilzomib或多种经典激活剂处理J-lat 10.6细胞2小时内的胞核蛋白,并采用蛋白质免疫印迹来分析多种转录调控因子(包括转录起始因子NF-κB、NFAT、AP-1、HSF1、转录延伸因子p-TEFb、染色质表观修饰酶p300)的核内累积水平。以此来判断潜伏HIV激活剂对转录起始因子、转录延伸因子、染色质解构因子的促进或抑制作用。另外,我们通过提取潜伏激活剂或与相应抑制剂共处理细胞后的总蛋白,采用WB分析HIV蛋白p24、细胞应激反应标志物p-eIF2α(a subunit ofeukaryotic translation initiation factor)、HSP90、CDK9等蛋白的表达水平,从而评估激活剂或抑制剂对这些蛋白总体水平的影响。4.荧光定量PCR (qPCR)研究通过提取激活剂处理J-lat 10.6、U1、ACH2、PBMCs、CD4+T细胞等细胞12、24或48小时的总RNA,随后逆转录成第一链cDNA,最后运用相应基因引物针对HIV转录调控区LTR、HIV相关基因、转录因子相关基因、免疫因子基因、细胞表面受体基因等进行检测。运用荧光定量PCR实验获得对应基因和样本的Ct (cycle threshold)值,通过计算Ct值来分析对应基因的相对表达增长倍数,从而来判断激活剂如Salubrinal、Bortezomib和Carfilzomib等对HIV基因(LTR、Gag、Tat、Vif、Vpr)、转录因子相关基因(HSF1、RelA、NF-κB1、 c-foc、ATF3、NFATcl和NFATc2)、细胞因子基因(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6, IL-10、IL-12P、IL-13、IL-17α、IL-18)转录水平的促进作用,以及对细胞表面受体(CD86, CD69、CD4、CXCR4)的抑制作用。荧光定量PCR结果在基因水平印证WB所获得的蛋白水平的结果,使得本文研究数据更加充实可信。5.酶联免疫吸附测定(ELISA)为检测激活剂Carfilzomib对天然免疫因子IL-1p和IL-18释放的影响,研究通过收集Carfilzomib刺激J-lat 10.6和Jurkat细胞不同时间点后细胞培养上清,运用ELISA法来检测细胞培养上清中IL-1β和IL-18的浓度。以此来评估激活剂对细胞天然免疫反应的促进作用和对潜伏HIV激活后免疫清除步骤的有利影响。6.激光扫描共聚焦显微镜(Confocal)研究采用激光扫描共聚焦显微镜技术来定位HSP90和CDK9两个分子在激活剂Carfilzomib的刺激下在U1细胞内的分布,通过分析二者是否共存于处理后的细胞中来初步判断二者是否存在直接相互作用关系。7.免疫共沉淀(Co-IP)为探究HSF1在潜伏HIV转录活化中的分子机制,我们采用免疫共沉淀技术分析与转录起始因子HSF1产生直接相互作用的细胞调控因子,其中包括转录延伸因子亚基CDK9、CyclinT1和乙酰化酶p300。通过分析HSF1对p-TEFb的募集作用从而来证明HSF1促进转录延伸的功能,并通过分析HSF1对p300的募集作用来探索HSF1乙酰化在潜伏FIIV活化中发挥的作用。同时,我们采用IP来分析HSF1自身的乙酰化修饰水平。除此之外,我们运用Co-IP分析CDK9与HSP90之间的直接结合作用并采用IP分析CDK9在Carfilzomib刺激下的泛素化水平。8.凝胶迁移实验(EMSA)研究通过核质分离法提取Salubrinal处理J-lat 10.6细胞2小时内的核蛋白,采用核蛋白与带有生物素标记的HSF1或NF-κB探针分别共同孵育,最后通过非变性胶来分离迁移条带。此方法可在胞体外鉴定转录因子HSF1和NF-κB与HIV转录调控区LTR产生的结合作用。9.染色质免疫共沉淀(ChIP)为进一步分析转录因子HSF1和NF-κB在细胞内的天然状态下与HIV转录调控区LTR的结合作用,研究运用染色质免疫共沉淀来分析HSF1和NF-κB在激活剂刺激下结合于HIV LTR的量。研究分别采用HSF1和RelA抗体来做ChIP实验,通过定量PCR来分析HSF1和RelA抗体拉下来的基因组DNA中HIV LTR的量。此实验真实地反应HSF1和NF-κB在激活剂刺激下与HIV LTR的结合情况。10. TALEN敲除为深入探究HSF1对于HIV转录的关键作用,我们采用TALENC transcription activator-like effector nuclease)技术敲除HSF1基因。根据HSF1基因(NCBI gene ID:3297)设计TALEN臂,并使用FAST TALEN Kit构建TALEN臂质粒。五个质粒以L2xR3交互组合方式转染293T细胞,经嘌呤霉素筛选3天,随后通过基因组PCR产物测序分析得到敲除效率最佳组合。最后通过2周的单细胞培养方式筛选敲除的单克隆细胞,并通过测序和WB鉴定得到293 T-HSF1-/-(-4bp/-10bp)敲除细胞系。11.质粒转染研究采用pNL4-3-luc单独转染或与pEZ-HSF1共转染293T-WT或293T-HSF1-/-细胞来探索HSF1高表达或缺失对HIV转录的影响。转染试剂与质粒DNA按比例转染细胞24小时后,裂解细胞,检测荧光素活性。根据相对活性倍数来评估HSF1对HIV转录的影响。12.数据分析文中所有柱状图及线图均采用GraphPad Prism 5.0软件来制作,所有WB条带均使用Adobe Photoshop CS 5.0软件来处理,流式细胞数据采用FlowJo 7.6软件来处理,荧光图片使用Olympus FV10-ASW1.7 Viewer来分析。文中数据统计采用GraphPad Prism 5.0软件来分析,所有数据均以均数±标准差(Mean±SD)来表示,且p值定义如下：*p<0.05,***<0.01和***p<0.001。实验结果1.通过FCM筛选,我们发现热应激、免疫应激、氧化应激和内质网应激反应可在不同程度上促进潜伏HIV激活,且能有效引起应激反应标志物p-eIF2a水平增加。我们还发现,p-eIF2a去磷酸化酶GADD34抑制剂Salubrinal在引起应激反应的同时能促进潜伏HIV激活。这一结果在多种细胞模型包括J-lat 10.6、 U1、ACH2和病人离体CD4+T细胞上得到验证,证明了应激反应促进潜伏HIV活化作用具有普遍性。通过进一步研究,我们发现应激反应诱导剂Salubrinal活化潜伏HIV时不引起广泛T细胞活化。2.透过深入研究应激反应介导的潜伏HIV活化,我们发现HSF1在Salubrinal诱导的潜伏HIV激活中起主导作用,同时我们也检测到转录因子HSF1的下游效应因子HSP27、HSP70、HSP90广泛参与Salubrinal诱导的潜伏HIV激活过程。在深入研究HSF1参与潜伏HIV激活的分子机制过程中,我们不仅通过EMSA和ChIP实验证明HSF1结合于HIV LTR发挥转录起始作用,还通过Co-IP实验证明HSF1募集转录延伸因子p-TEFb来发挥转录延伸作用。除此之外,HSF1通过募集乙酰化酶p300促使自身发生乙酰化修饰也是HSF1介导潜伏HIV激活的重要机制之一。3.通过深入研究内质网应激诱导的潜伏HIV激活,我们发现蛋白酶体抑制剂Carfilzomib可在纳摩尔浓度级别高效低毒地激活潜伏HIV,且能在HIV病人离体CD4+T细胞上有效地增强经典激活剂Prostratin、SAHA、JQ1对潜伏HIV的激活作用。值得一提的是,Carfilzomib诱导的潜伏HIV不引起广泛T细胞活化的同时,还能选择性促进天然免疫反应因子IL-1p和IL-18的生成和释放。通过进步一探索蛋白酶体抑制剂介导的潜伏HIV活化,我们也发现HSF1在其中发挥主导作用。4.在对HSF1下游因子HSP90的研究中,我们发现HSP90抑制剂17-DMAG、 AUY922不仅可促进HSP90 mRNA和蛋白表达,还可在J-lat 10.6细胞上诱导潜伏HIV活化。此外,我们还证明HSP90抑制剂可增强蛋白酶体抑制剂和多通路经典激活剂激活潜伏HIV的效应。同样地,我们也发现p-TEFb在蛋白酶体抑制剂诱导的潜伏HIV活化中发挥重要作用。而通过Co-IP实验,我们证明HSP90可结合于p-TEFb亚基CDK9上保护CDK9减少泛素化介导的降解。5.通过探索HSF1介导潜伏HIV激活作用的广泛性,我们检测到HSF1的活化形式p-HSF1(Ser320)及HSF1下游因子HSP70和HSP90在经典通路激活剂Dilazep、SAHA、JQ1、Prostrating、TNF-α激活潜伏HIV的过程中均发挥作用。采用TALEN技术敲除HSF1基因后,我们得到293T-HSF1-/-(-4bp/-10bp)单克隆细胞株。通过在缺失HSF1和过表达HSF1的细胞株中转染pNL4-3-luc,我们发现HSF1敲除可大大削减HIV的转录活性,而过表达HSF1并且促使其转变成活性形式可促进HIV的转录。因此我们认为HSF1在HIV的转录中发挥着至关重要的作用,具有作为潜伏激活剂筛选靶点的潜力。最后,依据此效应靶点我们进行广泛筛选,得到一系列激活剂。本文结论本文的结果证明Salubrinal和Carfilzomib诱导的细胞应激反应可促进潜伏HIV活化,且不伴随广泛T细胞活化。其中蛋白酶体抑制剂Carfilzomib还可选择性促进天然免疫因子的释放。通过一系列细胞生物学和分子生物学实验我们证明应激反应诱导的潜伏HIV活化是通过转录起始因子HSF1介导的,其具体作用机理为：HSF1在应激反应下发生磷酸化(Ser320),p-HSF1入核后募集p300乙酰化自身从而活化；活化的HSF1与HIV LTR靶向结合,同时募集p-TEFb促进基因转录延伸；HSF1下游效应因子HSP90在此过程中与p-TEFb亚基CDK9结合发挥保护作用,从而产生对HSF1的正反馈效应。最后我们证明HSF1在HIV的转录中是不可或缺的,是HIV转录的关键因子,具有成为药物开发靶点的潜力。