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沙门菌(Salmonella)是一种重要的食源性病原菌,是引起人类食源性细菌病的主要病原,严重危害公共卫生安全。人类通常因食用沙门菌污染的食物而引起沙门菌病。近年来,肠炎沙门菌引起的食物中毒位于沙门菌血清型的首位。由于肠炎沙门菌具有水平传播和垂直传播的特性,沿着“从农场到餐桌”的食品产业链传播,因此,在畜禽养殖环节进行沙门菌净化是控制产业链中沙门菌污染的根本措施。疫苗接种不仅是防控家禽感染沙门菌的重要的策略之一,也是减少人类感染沙门菌的有效措施。目前,已有针对畜禽肠炎沙门菌的商品化活疫苗和灭活疫苗,但商品化亚单位疫苗较少。利用DNA重组技术获取纯抗原成分制备的亚单位疫苗,因其结构单一、安全性好、无毒副作用,又能够提供很好的免疫保护作用,是比较理想的候选疫苗。为了研制针对禽肠炎沙门菌病的亚单位疫苗,本研究选择免疫原性好的外膜蛋白OmpC和OmpF为靶标,成功构建了 OmpC与OmpF外膜蛋白的原核表达载体,经诱导表达和纯化后获得纯包涵体蛋白。将包涵体蛋白进行变复性和纯化后,将目的蛋白配合弗氏佐剂分别免疫雏鸡,明确两种外膜蛋白的免疫保护效果,再配合不同商品化佐剂制成亚单位疫苗进行免疫保护实验、攻毒后细菌定殖实验、血清抗体IgG动态监测试验,并在免疫后检测了肝脏和脾脏中相关细胞因子mRNA的转录水平,进而筛选出合适的亚单位疫苗靶标。同时以超速离心方法提取肠炎沙门菌C50041的外膜囊泡OMV,与外膜蛋白OmpC和OmpF的免疫保护效力进行比较分析,为沙门菌外膜蛋白和OMV开发成为肠炎沙门菌亚单位疫苗提供了材料和依据。1.肠炎沙门菌外膜蛋白OmpC与OmpF蛋白的表达和纯化及外膜囊泡OMV的提取以肠炎沙门菌标准株C50041基因组为模板,PCR克隆外膜蛋白编码基因ompC和ompF,经一步法连接构建至原核表达载体pET30a(+)上,获得重组原核表达质粒pET30a(+)-ompC和pET30a(+)-ompF,经PCR与测序验证正确后,转化至工程菌E.coli BL21(DE3)中,获得重组表达肠炎沙门菌外膜蛋白OmpC与OmpF的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达后,检测出外膜蛋白OmpC和OmpF主要以包涵体形式表达,通过蛋白变性、复性与纯化获得了重组表达的肠炎沙门菌外膜蛋白OmpC与OmpF。同时,利用超速离心法提取肠炎沙门菌C50041的外膜囊泡OMV,经透射电子显微镜下观察其形态结构完好,为肠炎沙门菌亚单位疫苗的研制提供了生物材料。2.肠炎沙门菌外膜蛋白OmpC、OmpF和外膜囊泡OMV免疫保护效力的初步研究将纯化获得的外膜蛋白OmpC、OmpF分别与弗氏完全佐剂、OMV混合后,以肌肉注射的途径免疫7日龄的海兰白雏鸡;在14日龄时,将目的蛋白OmpC、OmpF分别与弗氏不完全佐剂、OMV混合后进行加强免疫;7日后以肌肉注射的方式人工感染野生型肠炎沙门菌禽源分离株CZ14-1,剂量为2.0×109CFU/只。结果显示,外膜蛋白OmpC和OmpF免疫后能够对CZ14-1的攻毒产生70%和75%的保护力,OMV与外膜蛋白OmpC和OmpF分别混合免疫后产生80%和100%的保护力,未免疫组的存活率为25%,且免疫组体重净增量与未免疫组无显著差异。外膜蛋白OmpF能够提供比OmpC更好的保护效果。混合OMV的外膜蛋白能够提供比弗氏佐剂更好的保护效果。将外膜蛋白OmpF分别与Quil-A、铝佐剂、弗氏佐剂混合后,以肌肉注射的途径免疫7日龄的海兰白雏鸡,在14日龄进行二次免疫,7日后以肌肉注射的方式人工感染肠炎沙门菌野生株CZ14-1,剂量为2.0×109CFU/只。结果显示,Quil-A、铝佐剂、弗氏佐剂对野生株的攻毒分别提供95%、85%、75%的保护力,单独OMV免疫能够产生90%的保护力,未免疫组的存活率仅为30%,且免疫组体重净增量与未免疫组无显著差异。为了评价疫苗在清除病原菌方面的效果,调整攻毒剂量为2.0×108CFU/只,在1、3、7、14、21、28、35天对各免疫组鸡群进行剖检和计数各脏器组织中定殖的细菌数,结果显示添加Quil-A佐剂的OmpF免疫组及OMV单独免疫组清除细菌的能力最强,分别于14天和7天清除沙门菌在肝脏内的定殖,两者于21天清除细菌在脾脏内的定殖。利用间接ELISA检测血清中的IgM和IgG抗体,结果显示,免疫组在免疫后1周即可在血清中检测到IgM和IgG抗体,抗体水平在加强免疫后逐渐上升。荧光定量PCR方法检测各免疫组在免疫过程中脾脏细胞因子的表达,结果显示,与对照组相比,IL-4、IL-6和IFN-γ表达水平显著上调。研究表明OmpF与OMV都具备开发成为禽肠γ炎沙门菌亚单位疫苗的前景。