论文部分内容阅读
目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)普遍认为是始于血管内皮细胞(Endthelialcells,ECs)损伤和新生的慢性炎症反应过程,其发病机制并不清楚。趋化因子介导血管内皮细胞参与动脉粥样硬化炎症反应,STAT3信号通路是血管细胞迁移增殖的重要调控途径,miR-15a-5p在动脉粥样硬化病理状态下表达降低。STAT3如何与趋化因子CX3CL1相互作用,影响炎症反应参与内皮细胞增殖?miR-15a-5p是否参与了STAT3/CX3CL1相互作用?对血管内皮细胞炎症反应和增殖相关基因转录因子网络的研究具有创新性,对寻找解决动脉粥样硬化相关的基础问题的突破点具有重要意义。本文围绕miR-15a-5p抑制IL-6/STAT3信号通路在介导CX3CL1调控内皮增殖展开研究。方法:构建CX3CL1的表达质粒,通过划痕实验、MTT、和EDU检测CX3CL1对内皮细胞的作用。在内皮细胞转染miR-15a-5p,通过划痕实验、MTT、和ED U检测miR-15a-5p对内皮细胞的作用。构建CX3CL1的3’UTR区域荧光素酶报告基因质粒pmir GLO-CX3CL1-WT-3’UTR以及其序列突变质粒pmir GLO-CX3C L1-MUT-3’UTR,利用荧光素酶活性实验、Western bloting和细胞免疫荧光分析miR-15a-5p对CX3CL1转录调控和表达的影响。构建STAT3表达质粒,分别用IL-6刺激细胞和转染STAT3后通过划痕实验、MTT、和EDU检测对内皮细胞增殖迁移的影响。用不同浓度的IL-6来刺激人脐静脉内皮细胞通过q PCR、Wester n BLot实验检测p-STAT3,STAT3及CX3CL1水平,同样通过时间梯度确定最佳作用时间。构建含有STAT3结合位点及突变STAT3结合位点的CX3CL1启动子荧光素酶报告基因质粒,利用荧光素酶活性分析STAT3对CX3CL1启动子转录活性的作用。构建荧光素酶报告基因质粒p GL3-miR-15a-5p-WT及其启动子上GAS区突变序列的p GL3-miR-15a-5p-MUT;利用荧光素酶活性分析STAT3对m i R-15a-5p启动子转录活性的作用。结果:根据上述实验方案,得到以下结果:CX3CL1能促进内皮细胞的增殖迁移而过表达miR-15a-5p抑制内皮细胞的增殖迁移。荧光素酶活性实验分析发现miR-15a-5p是通过作用于CX3CL1 3’UTR上抑制CX3CL1的表达从而影响内皮细胞的增殖迁移。用IL-6刺激内皮细胞和过表达STAT3能促进内皮细胞增殖迁移,同时用IL-6刺激细胞后能上调p-STAT3、CX3CL1水平;而STAT3又能通过与CX3CL1启动子上的GAS区结合促进其转录活性和表达从而促进内皮细胞增殖迁移。另外STAT3也能通过作用于miR-15a-5p启动子GAS位点促进其转录活性可能对对CX3CL1的调节有一个微弱的负反馈作用。miR-15a-5p-IL-6/STAT3/CX3CL1的模型可以调节内皮细胞的细胞增殖迁移过程从而影响动脉粥样硬化的发展。结论:血管损伤的炎症作用贯穿了AS发生、发展的过程,趋化因子与动脉粥样硬化之间的关系受到越来越多的关注,CX3CL1在动脉粥样硬化病理状态下表达增高。本实验证明了IL-6/STAT3通路的激活促进了CX3CL1的表达,而miR-15a-5p能通过与CX3CL1 3’UTR结合相互作用干扰炎症因子介导下的CX3CL1的表达,miR-15a-5p抑制IL-6/STAT3信号通路介导的CX3CL1调控内皮增殖。这对积极研究动脉粥样硬化的调控机制,寻找新的调控基因及分子标志物、并对动脉粥样硬化的早期诊断、预后及寻找新的治疗靶点具有重要意义。