产酶溶杆菌中与全局性调控因子Clp蛋白互作的转录因子的鉴定与功能研究

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产酶溶杆菌OH11(Lysobacter enzymogenes OH11)是本实验室从辣椒根际土壤中分离得到的一株具有广阔应用前景的重要生防细菌,其能产生多种胞外酶和次生抗菌代谢产物,对多种植物病原真菌、卵菌和革兰氏阳性细菌均有较强的抗菌活性。Clp(cAMP-receptor like protein)是产酶溶杆菌中鉴定的一个转录调控蛋白,属于CRP(cyclic AMP receptor protein)蛋白家族。之前的研究发现,将clp缺失突变以后其产HSAF的能力显著降低,并且HSAF生物合成的关键基因pks/nrps的转录表达也显著下降。本实验室研究发现Clp可以通过直接结合在pks/nrps基因的启动子区来调控HSAF的生物合成。为深入揭示产酶溶杆菌中Clp调控HSAF生物合成的分子机制,本研究通过筛选与Clp蛋白互作的转录因子,从中发现调控HSAF生物合成的目标转录因子。在此基础上,研究该目标转录因子是如何通过与Clp蛋白互作来调控HSAF生物合成的。在本实验室构建的OH11转录因子pTRG文库的基础上,本研究通过细菌双杂交系统筛选到14个与Clp蛋白存在相互作用的转录因子,对筛选到的这14个转录因子进行缺失突变得到其突变体。对这些突变体进行了 HSAF产量检测,拮抗活性测定,Twitching motility观察,胞外水解酶以及菌体沉降性检测。发现Le1703突变体HSAF产量显著下降,其对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)和梨腐烂病菌(Valsa mali)的拮抗能力也有明显下降,但并没有丧失TM和胞外酶分泌能力,也没有影响菌体沉降性。而其它突变体与野生型相比并没有显著差异。通过NCBI分析,本研究将Le1703命名为LysRLe。这些结果表明,LysRLe参与调控HSAF的生物合成。通过构建LysRLe蛋白原核表达载体,并对其诱导表达条件进行优化,得到了大量纯化的LysRu蛋白。通过EMSA和细菌单杂交试验表明:LysRLe蛋白可直接结合在pks/nrps基因的启动子区来调控HSAF的生物合成。LysRLu可以通过直接结合在pks/nrps基因的启动子区来发挥功能,而且本研究利用GST pull-down技术再次证明了 LysRLe和Clp蛋白间存在相互作用。在本研究中,在LysRLe结合pks/nrps基因启动子区的EMSA实验中添加Clp蛋白,并且也在Clp结合pks/nrps基因启动子区的EMSA实验中添加LysRLe蛋白。结果显示:LysRLe与Clp彼此能够增强与pks/nrps基因启动子区的结合。另外,通过获得△LelysR△Leclp双突变体,对野生型OH11、ALeclp、△LelysR以及双突变体△LelysR△Leclp的pks/nrps表达量进行定量检测。结果表明:相比较单突变体△Leclp和ALelysR,双突变体ALelysR△Leclp的pks/nrps表达量进一步降低。这些研究结果初步表明:LysRLe与Clp发生相互作用后协同调控HSAF的生物合成。
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