灰霉病是果蔬中一种广泛流行的真菌性病害,对其防治极为困难。引起灰霉病害的灰霉菌（Botrytis cinerea）可利用分生孢子进行扩散,并通过产生菌核度过逆境。在灰霉菌的分生孢子和菌核中会积累大量的DHN黑色素。黑色素普遍存在于真核生物体内,大多数病原真菌会在生活史的特定阶段积累黑色素。目前对真菌黑色素的功能研究较多,然而关于病原真菌黑色素中间产物的代谢机理及其生物学作用仍不清楚。本研究以灰霉菌为研究对象,通过分子遗传学和细胞学方法,对灰霉菌黑色素合成中间产物小柱孢酮（scytalone）的功能及转运机制进行了解析,深入揭示真菌DHN黑色素中间产物的代谢机理与合成酶的亚细胞定位,并详细解析黑色素合成的生物学功能,具体研究结果如下:1、通过同源重组敲除策略获得黑色素合成基因bcscd1缺失突变体。在突变体中,黑色素缺失,分生孢子产量降低;菌核萌发严重受损。为了进一步探究Δbcscd1菌核萌发受损的原因,对上游特异参与菌核黑色素合成的bcpks12基因缺失突变体进行分析,发现缺失黑色素的Δbcpks12菌核萌发正常,表明菌核萌发受阻并非黑色素缺失造成。根据灰霉菌DHN黑色素的合成途径可能的中间产物种类分析,我们推测在Δbcscd1中积累的中间物质scytalone是导致菌核萌发受阻的原因。2、为了进一步解析scytalone是否对灰霉菌菌核的萌发有抑制作用,采用丙酮萃取,柱层析纯化方法,获得中间产物scytalone。将其体外处理灰霉菌野生型的分生孢子,发现scytalone可以影响孢子萌发以及萌芽管伸长。而用scytalone上游合成酶的抑制剂三环唑处理,减少Δbcscd1菌核中scytalone的积累量,菌核萌发受损的程度得到减缓。以上结果表明scytalone的积累会抑制灰霉菌孢子及菌核萌发。3、为了解析灰霉菌在黑色素合成过程中是如何避免scytalone对自身的抑制作用,我们首先对scytalone脱水酶进行了亚细胞定位观察,发现其主要定位于细胞壁,说明scytalone能被分泌到细胞壁上进行后续黑色素合成反应,这种中间产物外排的机制也可避免其对细胞自身的抑制作用。Bc BRN还原酶是scytalone的上游合成酶,对其进行亚细胞定位观察发现其主要定位于内含体,且scytalone积累量与内含体数量有直接的关系,即scytalone在内含体中产生转运至细胞壁上。表明scytalone的合成与转运依赖于胞内囊泡运输系统。4、为了进一步探究灰霉菌黑色素的合成转运机制,我们对参与黑色素合成的其它酶Bc PKS12、Bc PKS13、Bc YHG1也进行了亚细胞定位观察,发现上述合成酶定位于细胞内较小的囊泡状结构,推测为过氧化物酶体。结合上述合成酶亚细胞定位的结果,我们推测出灰霉菌黑色素合成转运的模型。Bc PKS12、Bc PKS13、Bc YHG1在过氧化物酶体中,以乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A为底物,合成T4HN。T4HN转运到内含体,BRN还原酶在内含体中将T4HN转变为scytalone。Scytalone依赖内含体转运到细胞壁上进行后续反应,在Bc SCD1作用下,生成T3HN。T3HN在位于细胞壁的Bc BRN还原酶的作用下,生成vermelone。而vermelone继续在Bc SCD1作用下生成1,8-DHN黑色素,聚集在细胞壁上发挥功能。综上所述,本研究明确解析了灰霉菌黑色素合成的中间产物scytalone对灰霉菌生长发育的抑制作用,并证明灰霉菌依赖内含体系统,以将中间产物外排至胞外进行后续合成反应,并推测灰霉菌可能利用此机制来避免中间产物对细胞自身的抑制作用。本研究也提出过氧化物酶体及内含体会参与黑色素合成,为进一步研究灰霉菌其它次级代谢物或相关毒素合成的胞内划分及转运提供了理论基础。