单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种胞内寄生菌,在自然环境中广泛存在,且对不良环境抵抗力较强,甚至在4℃也能生长繁殖,可以污染多种食品导致食源性疾病,其致死率高达20%以上,因此受到世界范围的普遍关注,各国政府都制定了严格的防控措施和食品安全限量标准。单增李斯特菌检测方法可分为4大类：分离培养、免疫学方法、分子生物学技术和仪器分析法。其中免疫学方法在微生物快速检测中的地位毋庸置疑,它主要以抗原抗体反应为基础,因此抗体是免疫学方法中的核心试剂。但是免疫学方法使用过程中人们发现了抗体存在的一些不足,例如生物抗体存在获取耗时、不易保存、批次不稳定等缺陷。随着科学技术的发展,有学者发现了一种与抗体具有相似功能的新型配体--适配子。它相比于生物抗体具有便于修饰、性质稳定、可以无限合成等优势,已经成为医学领域和生物学领域的研究热点。许多研究证明适配子有望替代生物抗体应用于临床治疗和微生物检测技术。本文通过筛选获得能够与单增李斯特菌特异性结合的ssDNA适配子,并采用酶联配体吸附法(Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay, ELASA)对适配子应用于检测方法的能力进行了初步探索。首先体外合成全长为85bp的ssDNA文库,该ssDNA两端为引物序列,中间含有40bp随机序列。以单增李斯特菌为靶标,采用指数富集配基的系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术从ssDNA文库中筛选能与单增李斯特菌特异性结合的ssDNA,共进行15轮筛选。每轮筛选的次级文库利用亲和素标记的引物进行扩增,以链霉亲和素磁珠回收目标扩增产物。同时每轮筛选的次级文库利用地高辛标记的引物进行扩增,扩增产物与单增李斯特菌结合,通过抗地高辛抗体碱性磷酸酶显色系统测定次级文库与单增李斯特菌的结合力,以OD405nm表示。结果显示链霉亲和素磁性微球可以有效回收目的DNA,提高筛选效率。ssDNA与单增李斯特菌的结合力从第1轮的OD405nm为0.051逐步提高,到15轮筛选之后OD405nm提高到0.69。通过对获得的适配子克隆测序获得了23条适配子序列,序列比对发现适配子的一级结构的同源性不高,最长的有7个碱基同源。通过RNAstructure软件对23条适配子二级结构进行了分析预测,根据二级结构的相似性可以分为4个家族。23条适配子与单增李斯特菌的亲合力进行了测定,结果显示结合能力较高的6条适配子中有4条属于第4家族。选取21号和35号适配子与其它单增李斯特菌反应,结果显示21号和35号适配子具有较好的特异性。选取亲和力较强的适配子建立夹心ELASA来检测单增李斯特菌。亲和素标记的适配子与链霉亲和素结合被吸附到酶标板上,作为捕获配体,加入待检样品,洗涤后加入另一条亲和素标记的配体,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素结合,加入TMB底物进行显色,测定OD450nm。通过实验对反应体系进行优化,结果显示链霉亲和素以6μg/mL采用干法包被酶标板效果较好,捕获适配子的浓度为40nmol达到饱和,酶促反应最佳显色时间为15min。将培养的细菌液作10倍倍比稀释后测定该方法的灵敏度,结果显示该方法对单增李斯特菌最低检测浓度为104CFU/mL。用ELASA法检测李斯特菌属内和非李斯特菌属的细菌,结果显示以P/N值≥2.1作为阳性的判断标准,可以特异地检测单增李斯特菌。并用该方法检测人工污染牛奶样品,通过8h的增菌,可以检测出单增李斯特菌。本研究通过SELEX筛选获得23条单增李斯特菌适配子,选取2条适配子应用于夹心ELASA检测方法,结果显示该方法能够特异性地检测单增李斯特菌,而且具有较好的灵敏度,这充分显示适配子作为新型配体在检测中应用的巨大潜能,也为其它病原微生物适配子筛选和检测提供借鉴。