三叶崖爬藤种质资源评价及质量控制技术研究

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三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)是中国特有的葡萄科崖爬藤属植物,分布于中国南部地区。其块根入药,具有抗炎、阵痛、解热的功效。主治高热惊厥、肺炎、咳喘、肝炎、肾炎、风湿痹痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等症。其中主要的活性化学成分为多酚类。作为民间常用的抗肿瘤草药,近年来对该植物从药理活性到化学成分的研究都很热门。由于该植物地域分布广,已有研究表明不同产地的样品在显微结构及药理活性上都有差异,那么不同产地的三叶崖爬藤在化学成分上是否有差异,这种差异是由遗传还是由环境因子引起,这方面的研究未见报道。因此,本文针对三叶崖爬藤药材的质量控制,采用11个野生群体的样品从遗传(采用cpDNA和nSSR)、环境(气候因子和土壤因子)及药理作用(体外抗肿瘤活性)等方面开展相关研究,分析各因素对药材化学多样性的影响,探讨三叶崖爬藤品质的成因,为三叶崖爬藤引种驯化和品种选育提出科学的建议,为三叶崖爬藤药材持续发展奠定研究基础。主要研究结果如下:(1)利用波谱学方法和质谱技术从三叶崖爬藤中鉴定出4种化合物,分别是白皮杉醇、白藜芦醇、异槲皮苷、烟花苷。通过对照品比对及加样回收率确定样品中含有虎杖苷。这是首次从该植物中分离到白皮杉醇。(2)利用高效液相分析技术结合多变量数据处理方法构建三叶崖爬藤的化学指纹图谱与五种主要指标性成分定量分析相结合的化学多样性评价体系,在此基础上,将全国13个野生产地的三叶崖爬藤划分为3种化学型。(3)基于cpDNA和核微卫星(SSR)两套分析标记显示:三叶崖爬藤物种具有较高的遗传多样性水平(cp DNA,h=0.227;SSR,He=0.428);种群间遗传分化显著(cp DNA,Fst=0.749,P<0.001;SSR,Rst=0.369,P<0.001);两套分子标记都将三叶崖爬藤分成2个谱系(cpDNA:广西一支,其余一支;SSR:浙江一支,其余一支),这两个谱系的种群在化学成分上的分化同遗传上的分化不一致。遗传距离与化学距离的Mantel test检验说明化学距离同基于叶绿体、SSR标记计算的群体间遗传距离均不相关(FST,r=0.091,P=0.310;RST,r= 0.122,P=0.204),进一步证实三叶崖爬藤化学成分的变异受本文所选的遗传标记的影响较小。三叶崖爬藤不同种群五种化学成分的含量差异显著(P<0.007),芪类化合物(stilbene)高的种群主要是浙江宁波、湖北利川和重庆金佛山;黄酮类化合物(flavonoid)高的种群是广西南丹和湖南吉首。(4)通过广义线性混合模型分析了13个气候及6个土壤因子对三叶崖爬藤五种指标性成分的影响,阐明了气候因子和土壤因子对三叶崖爬藤化学成分的贡献率。结果发现气候因子对三叶崖爬藤化学成分的贡献率为35%,土壤因子为28%。影响化学成分积累的主要气候因子是相对湿度、年降水量和年日照时数;土壤因子主要是pH值、速效钾、速效磷和土壤有机质含量。(5)采用响应曲面法以总酚含量和铁还原抗氧化能力(FRAP)为检测指标进行提取方案的优化。得到三叶崖爬藤中总酚最优提取方案为乙醇浓度:70%,提取温度:50℃,提取时间47 min。按照最优方案实际得到的总酚含量为5.51 mg没食子酸/每克干药材,FRAP相当于92.10μmol硫酸亚铁/每克干药材,与模型预期值相符。(6)不同干燥处理显著影响药材的总酚含量、抗氧化水平以及药材的抗肿瘤活性。相关性分析揭示不同干燥处理的药材总酚含量与FRAP、羟基氧自由基和DPPH的清除活性呈正相关。不同干燥处理的药材醇提物的乙酸乙酯部位体外抗肿瘤活性显示:对K562肿瘤细胞株,30℃干燥处理、冷冻干燥和室温阴干都具有较强的抗肿瘤活性。而对A549肿瘤细胞株,30℃干燥处理和室温阴干具有较好的抗肿瘤活性。HPLC分析结果显示:30℃干燥处理的药材中白皮杉醇和白藜芦醇的含量显著上升。综合总酚含量、抗氧化、体外抗肿瘤活性以及药材中五种指标性成分的定量分析结果,作者推荐采用30℃干燥处理的加工方法。结论:三叶崖爬藤不同种群间化学成分存在着显著差异,浙江宁波和四川金佛山的种质在化学成分的含量以及体外抗肿瘤活性方面表现较好,可以作为育种的首选材料。
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