【摘 要】
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背景:β-半乳糖苷酶通过催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖在工业上被广泛应用于生产低乳糖牛奶。该酶在工业和生物技术方面还具有其他重要的应用,包括乳清处理、低聚半乳糖的生产以及乳糖的生物转化（其产品可易于转化为生物乙醇）。因此,β-半乳糖苷酶的表达和纯化技术已然成为当前较为重要的研究课题。研究方法:本研究将来源于乳酸菌sp.B164的β-半乳糖苷酶基因分别与六聚组氨酸标签（6x His）形成重组质粒p
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背景:β-半乳糖苷酶通过催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖在工业上被广泛应用于生产低乳糖牛奶。该酶在工业和生物技术方面还具有其他重要的应用,包括乳清处理、低聚半乳糖的生产以及乳糖的生物转化（其产品可易于转化为生物乙醇）。因此,β-半乳糖苷酶的表达和纯化技术已然成为当前较为重要的研究课题。研究方法:本研究将来源于乳酸菌sp.B164的β-半乳糖苷酶基因分别与六聚组氨酸标签（6x His）形成重组质粒p ET28a（+）β-Gal-His（β-Gal-LH）;与类弹性蛋白（Elastin-like Polypeptide,ELP）和六聚组氨酸标签形成重组质粒p ET28a（+）β-Gal-ELP-His（β-Gal-LEH）。两种重组质粒分别亚克隆到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行蛋白表达,得到融合蛋白β-Gal-LH和β-Gal-LEH。对表达的融合蛋白β-Gal-LEH通过可逆相变循环（Inverse transition cycling,ITC）和镍柱亲和层析（Ni-NTA）进行纯化,对β-Gal-LH则仅采用镍柱亲和层析进行纯化。并对上述两种方法的纯化效率及其纯化酶的生化特性进行评估。结果:（1）利用ELP标签的热相变性以ITC方式分离纯化融合蛋白GEH。确定ITC纯化GEH的最适盐离子及浓度为1.75 M（NH4）2SO4。β-Gal-LEH的一轮ITC的纯化倍数为13.04,活力回收率为95.66%;β-Gal-LH的Ni-NTA的纯化倍数为13.85,活力回收率为45.97%。表明ITC纯化效果优于Ni-NTA。此外,二轮ITC导致了纯化酶数量的减少,纯度方面与第一轮相比没有差异,表明一轮ITC足以实现高蛋白质纯度。（2）β-Gal-LEH和β-Gal-LH的酶活、米氏常数（Km）和催化效率（Kcat/Km）分别为177.92 U/mg、10.5 m M、5.97 S-1m M-1和122.90 U/mg、15.7 m M和3.69 S-1m M-1。β-Gal-LEH和β-Gal-LH的最佳温度皆为40℃,最佳p H值皆为7.5。（3）β-Gal-LEH在50℃放置30分钟后,残留的活性为原活性的80%,而β-Gal-LH在50℃放置30分钟后,残留的活性为原活性的15%。β-Gal-LEH和β-Gal-LE在25℃条件下放置28天后,酶活剩余分别为原活性的92%和55%,表明β-Gal-LEH的热稳定性和储藏稳定性高于β-Gal-LH。此外,ELP标签不改变酶的二级结构。汞离子、铬离子和铜离子完全抑制β-Gal-LH和β-Gal-LEH活性;二胺四乙酸、尿素和钙离子对酶活没有影响;低浓度镁离子和锰离子可增加酶活。（4）β-Gal-LEH在乳糖底物上的水解效率的评估表明该酶在50℃下分别能在淡奶、脱脂奶和无蛋白乳清中产生浓度为80.84 mg/d L、69.30 mg/d L和64.96 mg/d L的葡萄糖。从乳酸克鲁维酵母和米曲霉中提取的β-Gal-LEH和β-半乳糖苷酶之间水解效率的对比分析进一步表明β-Gal-LEH可以有效地催化乳糖的水解,但与乳酸克鲁维酵母（3 h）相比,β-Gal-LEH可能需要较长的时间（27 h）。结论:通过此项研究表明,与传统的柱亲和层析法相比,ELP标记的蛋白可以显著提高蛋白质的纯化和产量,并且具有更高的酶催化活性。此外,ELP标记系统中使用ITC会更高效,成本更低,十分适用于乳糖的工业水解。
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