目的肿瘤化疗是治疗肿瘤的重要手段之一，它极大提高了肿瘤治愈的可能性。然而，肿瘤细胞耐药（Drug resistance）往往导致化疗的失败。肿瘤细胞对一种药物耐药后，往往也会对不同化学结构和不同作用机制的药物同时耐药，这就是多药耐药（Multidrug resistance，MDR）。目前，正在对MDR机理进行广泛的研究，其中由多药耐药基因（mdrl）编码的分子量为170kD的P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）过度表达造成的肿瘤细胞耐药是主要机制。因此，抑制或调节P-gp功能和／或表达是逆转肿瘤细胞MDR的关键。盐酸千金藤碱（Cepharanthine Hydrochloride，CH）是从防己科千金藤属植物的块根中提取分离，经成盐而得的一种双苄基异喹啉类单体化合物，具有较强的多种生物活性。最近国外研究显示其具有逆转多药耐药的作用，其逆转白血病细胞的多药耐药机制与P-gp的关系如何，目前尚未见报道。本实验采用细胞和分子生物学的检测方法，观察CH对肿瘤细胞耐药性的逆转作用，并对MDR的分子机制进行深入探讨。方法实验选择人慢性粒性白血病细胞株K562及由阿霉素（Adriamycin，ADR）诱导的具有稳定MDR表型的耐阿霉素细胞株K562／ADR。采用MTT（3-（4，5-dimethylthiazol）-2，5-diphenylte-2H-tetrazoloum bromide，MTT）分析法，测定ADR单用及分别与CH、维拉帕米（Verapamil，VER）合用对K562、K562／ADR细胞的直接细胞毒作用；采用阿霉素蓄积实验，流式细胞仪测定CH作用下，细胞内阿霉素蓄积量的变化；采用流式细胞术测定CH对K562细胞、K562／ADR细胞内P-gp表达水平的影响；采用罗丹明123（Rho123）蓄积和泵出实验，测定细胞内蓄积Rho123的荧光强度，分析CH对P-gp功能的影响。通过上述实验阐明CH逆转K562／ADR细胞对ADR的耐药性作用与P-gp表达和功能的关系。结果1．ADR对K562、K562／ADR细胞的细胞毒作用采用MTT法测定ADR对K562、K562／ADR细胞的细胞毒作用，其IC₅₀值分别依次为0.45±0.01μmol·L^-1和13.97±0.30μmol·L^-1，耐药倍数为31.04倍，二者比较差异有显著性（P＜0.05）。2．CH、VER分别与ADR合用对K562、K562／ADR细胞毒的影响单用CH、VER对K562及K562／ADR的细胞毒作用较弱，其结果为：CH 4μmol·L^-1时抑制率为（5.72±0.31）％和（5.26±0.76）％，VER 4μmol·L^-1时抑制率为（4.10±0.45）％和（3.95±0.20）％。ADR与4μmol·L^-1CH合用对K562细胞的IC₅₀值为0.44±0.02μmol·L^-1，与单用ADR比较差异无显著性（P＞0.05）；对K562／ADR细胞的IC₅₀值为1.88±0.10μmol·L^-1，与单用ADR比较差异有显著性（P＜0.05），逆转倍数为7.43倍。ADR与4μmol·L^-1VER合用对K562细胞的IC₅₀值为0.46±0.03μmol·L^-1，与单用ADR比较差异无显著性（P＞0.05）；对K562／ADR细胞的IC₅₀值为6.27±0.17μmol·L^-1，与单用ADR比较差异有显著性（P＜0.05），逆转倍数2.23倍。CH合用组与VER合用组对K562／ADR细胞的抑制作用比较差异有显著性（P＜0.05），CH的逆转作用强于VER。3．CH对K562／ADR细胞阿霉素蓄积的影响流式细胞仪测定0、2、4、8μmol·L^-1CH分别与5μg／mLADR共同作用2h后，K562／ADR细胞内ADR的荧光强度分别为3.1±0.3、6.4±0.4、16.5±0.6和22.8±0.7，各剂量组之间差异有显著性（P＜0.05）。4．CH对K562、K562／ADR细胞P-gp功能的影响采用Rho123蓄积和泵出实验检测用药前后P-gp功能的变化，Beckman流式细胞仪对细胞进行分析，以细胞内蓄积的Rho123荧光强度为量化指标。Rho123蓄积实验中，0、2、4、8μmol·L^-1CH组和4μmol·L^-1VER组，K562细胞内Rho123的荧光强度分别为81.5±0.4、81.4±0.3、81.7±0.3、81.3±0.5和81.2±0.2，K562／ADR细胞内Rho123的荧光强度分别为16.9±0.6、25.3±0.2、44.7±0.3、60.7±0.7和23.1±0.5；K562细胞各剂量组之间差异无显著性（P＞0.05），K562／ADR细胞各剂量组之间差异有显著性（P＜0.05）。Rho123泵出实验中，0、4、8μmol·L^-1CH组和4μmol·L^-1VER组，K562细胞内Rho123的荧光强度分别为77.0±0.5、77.2±0.1、76.8±0.3和77.4±0.3，K562／ADR细胞内Rho123的荧光强度分别为4.0±0.1、7.4±0.4、13.7±0.2和4.9±0.1；K562细胞各剂量组之间差异无显著性（P＞0.05），K562／ADR细胞各剂量组之间差异有显著性（P＜0.05）。5．CH对K562、K562／ADR细胞P-gp表达的影响采用流式细胞术对P-gp表达水平进行分析，K562对照细胞阳性率为0.3％，加PE标记P-gp单克隆抗体后，P-gp表达百分率分别为0.3％，两组之间差异无显著性（P＞0.05），说明K562细胞中无P-gp表达；对于K562／ADR细胞，0、2、4、8μmol·L^-1CH组和4μmol·L^-1VER组，P-gp表达百分率分别为（94.5±0.2）％、（94.6±0.1）％、（94.4±0.3）％、（94.5±0.1）％和（94.1±0.3）％，不同浓度CH组之间P-gp表达差异无显著性（P＞0.05），说明较低浓度的CH对P-gp表达无影响。结论1．CH可部分逆转K562／ADR细胞的耐药性。CH与ADR合用明显降低ADR对K562／ADR细胞的IC₅₀值，逆转倍数为7.43倍，其作用强于VER的逆转作用。2．CH浓度依赖性的增加K562／ADR细胞内ADR的蓄积。3．CH浓度变化不影响K562细胞中Rho123的蓄积和泵出；K562／ADR细胞随着CH浓度的增加，细胞内Rho123的蓄积增加，泵出减少。结果表明，CH逆转K562／ADR细胞的耐药作用可能与抑制P-gp的功能有关。4．K562细胞中P-gp无表达，而K562／ADR细胞P-gp较高表达；CH浓度较低时，逆转K562／ADR细胞的耐药作用与P-gp的表达无关。