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研究背景:胆汁酸转运蛋白对于维持BA(bile acids)的肠肝循环有重要作用。遗传和获得性BA转运蛋白缺陷涉及例如胆汁淤积、胆结石、脂肪肝、肝癌等多种肝胆管疾病。人BSEP(ABCB11)突变是至少3种临床上肝疾病的分子机制,BRIC2(良性复发性肝内胆汁淤积Ⅱ型)、PFIC2(进行性家族遗传性肝内胆汁淤积Ⅱ型)、ICP(妊娠期肝内胆汁淤积)。MRP2突变会引起DJS(Dubin-Johnson综合征)。核受体通过感受细胞内BAs的浓度紧密调节BA转运蛋白来维持BA平衡。除了核受体的调节外,转录后调控也起重要的作用。转录后调控可以通过插入和撤回细胞膜的转运蛋白发挥作用。与转录调控一起,转录后调控调节细胞膜转运蛋白的表达和活性。泛素化是一个可逆的翻译后修饰,最近的研究表明Ub(Ubquitin)修饰在更宽的领域和在细胞过程中有更多的功能。Kensuke Aida等人发现表达在肝细胞小管膜侧的ABC转运蛋白,如胆盐输出泵(BSEP)和多耐药相关蛋白2(MRP2)通过泛素化降解,而我们前期研究发现在梗阻性胆汁淤积中,这MRP2转运蛋白在总蛋白水平也有所下降。所以我们猜想,在梗阻性胆汁淤积中,小管膜MRP2通过内吞后,最后的归宿是经过泛素化至蛋白酶体降解。獐牙菜苦苷是从川西獐牙菜属提炼出来治疗黄疸的中国传统中药。UDCA和它的类似物能阻止炎症和增加毒性胆汁酸的消除。是目前在临床上广泛用来治疗胆汁淤积病人如PBC(原发性胆汁性肝硬化)的药物。然而1/3-2/3的PBC病人对UDCA没有很好的反应。INT747是FXR的激动剂,目前是二期临床研究药物,在模型中通过改变胆汁酸的代谢发挥抗胆汁淤积的作用。因此,寻找靶定炎症和胆汁酸池的药物治疗胆汁淤积有重要的临床意义。研究方法:1.我们收集了30例临床梗阻性胆汁淤积肝脏样品和14例正常对照肝脏样品,所有取到的样品立即切成小块装在冻存管内放入液氮罐保存,用时取出适量组织。2.人梗阻性胆汁淤积和正常对照肝脏样品中泛素连接酶(gp78,hrd1,teb4))、胆管膜转运蛋白(mrp2)、核受体(rxrα)mrna表达水平通过实时定量pcr检测。3.人梗阻性胆汁淤积和正常对照肝脏样品中泛素连接酶(gp78,hrd1,teb4))、胆管膜转运蛋白(mrp2)、核受体(rxrα)蛋白表达水平通过实时western-blot检测。4.mrp2和ubiquitin之间的蛋白间相互作用通过免疫共沉淀检测5.通过稳定转染gp78shrna敲减hepg2细胞中gp78表达,验证是否gp78在mrp2的降解中发挥重要作用。6.将所有大鼠随机分成3组(每组7只):假结扎生理盐水组,bdl生理盐水组,bdl獐牙菜苦苷组。bdl獐牙菜苦苷组第一次预灌一天獐牙菜苦苷(100mg/(kg/d),溶解于1%tween-20),第二天行bdl手术,继续灌胃至3d,7d,14d。7.血清样品alt,ast,alp,tba,tbil,dbil用试剂盒通过酶标法检测8.取样品时,假结扎生理盐水组,bdl生理盐水组,bdl獐牙菜苦苷组血清冻于-80℃,用时冰上解冻。通过elisa试剂盒检测三组大鼠中血清细胞因子(tnfα,il-1β,il-6)水平。9.通过试剂盒检测三组大鼠血清中cdca,tcdca,ca,tca,dca,tdca,tudca,α/βmca,αmca,βmca,tgh,tg,hdl-c,ldl-c的浓度。10.大鼠肝脏样品固定在4%多聚甲醛中,固定一周后石蜡包埋切片,标准流程做he染色。实验结果:1.实时定量pcr证实:在梗阻性胆汁淤积肝脏样品中gp78mrna表达量是正常对照肝脏样品的2.1倍(p<0.05),而且其他两个泛素连接酶(hrd1,teb4)则无明显变化。2.western-blot显示:在梗阻性胆汁淤积肝脏样品中gp78蛋白表达量是正常对照肝脏样品的4.2倍(p<0.05),而且其他两个泛素连接酶(hrd1,teb4)则无明显变化。3.提取梗阻性胆汁淤积肝脏样品和正常对照肝脏样品总蛋白,做免疫共沉淀实验,证实梗阻性胆汁淤积肝脏中mrp2的泛素化明显增加。4.用ubquition-egfp和ubquition-koegfp质粒瞬时转染hek293细胞,24h时后收取细胞总蛋白,然后做免疫共沉淀实验。结果表明,在转染ubquition-egfphek293细胞中mrp2的泛素化降解明显增加。5.用gp78shrna质粒筛选稳定转染的hepg2细胞,提取细胞株rna和总蛋白,real-timepcr结果显示,gp78敲减后,mrp2mrna表达量增加1.5倍(p<0.05),而rxrαmrna表达量无明显变化。Western-Blot检测显示GP78敲减后,MRP2蛋白表达量和RXRα蛋白表达量均增加(P<0.05)。6.14d时BDL灌獐牙菜苦苷组比BDL生理盐水组血清ALT,AST水平明显下降(P<0.05)7.BDL獐牙菜苦苷组在3d,7d时,血清TNFα含量明显降低,分别是BDL生理盐水组的63%和64%(P<0.05)。BDL獐牙菜苦苷组在3d,14d时血清IL-1β水平分别是BDL生理盐水组的43%和42%(P<0.05)。BDL獐牙菜苦苷组在14d时血清IL-6水平是BDL生理盐水组的61%(P<0.05)。8.BDL獐牙菜苦苷组与BDL生理盐水组相比,血清中CDCA浓度在7d,14d时降低,TCDCA浓度在7d明显降低(P<0.05)。血清CA水平在3d,7d,14d时降低(P<0.05)。血清TCA浓度在3d,14d后明显降低(P<0.05)。血清TDCA水平在7d明显下降(P<0.05)。血清TUDCA水平在14d明显下降(P<0.05)。血清αMCA水平在3d,7d,14d时明显降低(P<0.05),而βMCA水平在14d时明显降低(P<0.05)。实验结论:1.人梗阻性胆汁淤积肝脏样品中GP78 mRNA表达水平比正常对照肝脏样品中表达量明显增加。2.人梗阻性胆汁淤积肝脏样品中GP78蛋白表达水平比正常对照肝脏样品中表达量明显增加。3.人梗阻性胆汁淤积肝脏样品中MRP2泛素化较正常对照肝脏样品中明显增加。4.用GP78shRNA敲减Hep G2细胞中,GP78、MRP2 mRNA和蛋白表达水平明显增加。然而,RXRα仅蛋白水平表达增加,mRNA表达水平无明显变化。5.獐牙菜苦苷能减轻BDL大鼠肝损伤。6.獐牙菜苦苷对BDL大鼠有抗炎症的作用。7.獐牙菜苦苷能改变BDL大鼠血清中胆盐浓度。8.獐牙菜苦苷对BDL大鼠中磷脂水平无影响