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背景:刺梨(Rosa roxburghii)为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实,又名文先果、刺莓果、送春归等,广泛分布于暖温带及亚热带地区,我国主要分布在贵州、湖南等省份。刺梨具有消食健脾,收敛止泻的功效,由于其富含维生素C,故被称为“维C之王”,刺梨还含有人体所必需的微量元素,所以它具有较好的延缓衰老、调节机体免疫力、防癌等作用,现已出现以刺梨为原料的药品、果酒、果汁饮料等商品。刺梨籽为刺梨果实的籽粒,现有研究报道明确说明刺梨籽中含有多种脂肪酸类成分,此类成分具有清除自由基、抗炎、降血糖、保肝、抗癌等功能。而目前对刺梨籽的研究仅限于提取中低极性部位,经衍生化获得易挥发的酯化物,采用气相色谱或气相色谱-质谱联用进行定性和定量分析。此方法在酯化过程中存在各种副反应,难以保证酯化完全;对挥发性差和不易酯化的成分无法获得成分信息;分析时间长,使分析复杂化。目的:应用液质联用(Ultra performance liquid chromatography-Quadrupole-Time of flight-Mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MSE)技术对刺梨籽提取物的化学成分进行分析鉴定;使用微波消解-电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma-Mass spectrometry,ICP-MS)法测量刺梨籽中的微量元素含量;对刺梨籽提取物进行药理活性评价及抗肝癌作用机制研究,旨在为刺梨籽的进一步研究和产品开发奠定基础。方法:1.刺梨籽化学成分分析:采用液质联用(UPLC-Q-TOF-MSE)技术结合UNIFI筛查平台对刺梨籽甲醇提取物的化学成分进行分析鉴定,并总结黄酮类化合物和三萜类化合物的质谱裂解规律,将此规律应用到刺梨籽甲醇提取物中的化合物的快速识别。建立使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定刺梨籽中微量元素的分析方法,首先使用微波消解法对刺梨籽样品粉末进行前处理,然后以Re、Y、Rh、In、Sc为内标,采用外标标准曲线法对刺梨籽中的微量元素进行含量测定。2.刺梨籽药理活性评价:应用DPPH法评价刺梨籽提取物的体外抗氧化活性作用;使用左旋多巴(Levodopa,L-dopa)法检测刺梨籽提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用,并测定其对酪氨酸酶的抑制率;通过鸡胚绒毛尿囊膜(Chick chorioallantoic membrane,CAM)模型实验,探究刺梨籽提取物对CAM血管新生的抑制作用;运用MTT法探究刺梨籽提取物对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用。3.刺梨籽细胞增殖抑制作用机制研究:通过细胞划痕实验检测刺梨籽提取物对HepG2细胞迁移能力的抑制作用;通过Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测刺梨籽提取物对HepG2细胞凋亡率的影响;并通过Western Blot实验检测刺梨籽提取物对Bcl-2,Bax,Caspase-3和Caspase-9凋亡相关蛋白表达的影响作用。结果:1.利用液质联用技术采集刺梨籽甲醇提取物的质谱数据,并通过UNIFI筛查平台结合各化合物的相对保留时间、精确分子质量、特征性碎片离子以及相关文献等数据,共鉴定出刺梨籽提取物中的55种化合物,包括19种黄酮和36种三萜类化合物。通过考察精密度、加样回收率等方法学参数,建立了一种使用电感耦合等离子体质谱法测量刺梨籽中微量元素的分析方法,并测量了刺梨籽中15种微量元素的含量,为研究刺梨籽的元素种类、含量与其疗效的关系奠定了基础;为刺梨籽的物质基础及作用机制研究提供了数据支持;对更好地开发利用刺梨籽资源提供一定的参考作用。2.DPPH实验结果表明,刺梨籽提取物具有较强的体外抗氧化能力,通过比较刺梨籽样品和阳性对照药的IC50值可发现,其抗氧化能力强于抗坏血酸(Vc)。左旋多巴(L-dopa)法检测结果表明刺梨籽对酪氨酸酶具有较好的抑制作用,提示刺梨籽提取物可能通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素合成,从而起到美白、护肤等作用。鸡胚绒毛尿囊膜实验结果表明,刺梨籽提取物具有抑制血管生长的活性,该结果提示刺梨籽提取物可能通过抑制新血管的生成,从而抑制肿瘤细胞的生长和迁移,进而有效地抑制肿瘤组织生长、防治肿瘤。MTT实验结果表明,各浓度刺梨籽提取物样品对HepG2细胞的增殖抑制率具有剂量和时间依赖性,抑制作用随药物浓度增加而增加,同时也随作用时间的延长而增强(p<0.05),且差异均具有统计学意义。3.细胞划痕实验结果表明,刺梨籽提取物具有抑制HepG2细胞迁移的能力;且抑制作用随浓度增加而增强。细胞凋亡实验结果表明刺梨籽提取物可以诱导HepG2细胞发生凋亡,随着刺梨籽提取物样品浓度的增加,早期和晚期的HepG2细胞凋亡率之和明显增加(p<0.05),差异具有统计学意义。Western Blot实验结果表明,不同浓度刺梨籽提取物对Bax,Bcl-2,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达量均有影响,随着浓度增加,Bax蛋白表达水平逐渐增加;Bcl-2,Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达水平均逐渐下降。