磷脂酰丝氨酸（PS）因其独特的化学结构和保健作用,在食品、医药等领域得到了广泛的应用。然而,从动植物中提取PS存在成本高、操作繁琐以及提取率低等局限性。因此,磷脂酶D（PLD）介导的生物酶法合成PS因具有操作简单、反应条件温和以及对环境友好等优点而备受关注。但由于野生型磷脂酶D的低转磷脂酰活性导致利用磷脂酶D合成PS仍然是一个挑战。因此,在我们研究中,首先设计了融合标签MBP和PLD共表达的策略,实现了PLD在大肠杆菌中的可溶性表达。然后基于PLD催化机理和分子动力学模拟,提出一种“重构底物口袋”的策略,通过扩大底物口袋,操纵L-Serine（L-Ser）在活性部位的配位,进而提高了PLD的转磷脂酰活性。本论文的主要研究内容如下:（1）磷脂酶D的筛选及可溶性表达。首先,以转磷脂酰活性为标准,筛选到来源于Streptomyces racemochromogenes的PLD（SrPLD）作为亲本酶。然后,为了增加SrPLD的可溶性表达,在表达载体阶段加入融合标签,构建了4个具有不同融合标签的PLD表达质粒。结果显示,pET-28a-SrMBPPLD可溶性表达量最高,且在最佳的产酶条件下,其酶活为18.57 U·mL-1,是SrPLD的25.09倍。最后使用双相体系制备PS,确定了用于评价转磷脂酰活性的参数rtp/rh（0.77）。（2）蛋白质工程改造SrMBPPLD提高转磷脂酰活性。通过对SrMBPPLD的催化机制、分子对接和MD模拟分析发现底物结合口袋相对于大体积底物PC太小,且L-Ser侧链-OH基团远离H436,不利于H436的去质子化。为了提高转磷脂酰的活性,设计了“重构底物口袋”蛋白质改造策略。通过对PC、H166和H436附近的20个氨基酸进行饱和突变,最终得到最佳突变体SrMBPPLDMu6（L86E/W164Y/Y189R/D377G/Y379L）,其rtp/rh比值是野生型的2.04倍,kcat/Km值是野生型的28.69倍。此时,PS的产量为44.12 g·L-1,相应的转化率为59.21%。通过对SrMBPPLDMu6的结构以及与配体分子（PC和L-Ser）对接发现,SrMBPPLDMu6通过引入非极性以及较小侧链氨基酸,增加了活性位点的空间和疏水性,促进底物在结合口袋的灵活构象;通过形成新的氢键网络,操纵L-Ser在活性位点的配位,从而提高了H436从L-Ser获得质子的特异性。（3）磷脂酰丝氨酸生成条件优化。为了评价SrMBPPLDMu6催化合成PS的能力,在10mL的反应规模下,以最佳条件(20 g·L-1全细胞、环戊基甲基醚、pH 6.0、40℃、V（有机相）:V（水相）=3:1、PC与L-Ser的浓度比为1:4、反应时间为12 h)进行PS的生产。在此条件下,得到了58.63 g·L-1的PS,转化率为78.69%。将10 mL的反应体系扩大到3 L的发酵罐,12 h内PS的产量达到59.69 g·L-1,比WT(25.32 g·L-1)提高了135.74%,PS的时空转化率为4.97 g·L-1·h-1。