由小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引致的小麦条锈病是一类危害严重的小麦重大真菌病害。该病害传播快、发生范围广、成灾频率高，在国际上一直受到高度关注。但由于目前小麦条锈菌无法进行遗传转化，对病菌致病机制仍缺乏系统深入的了解，加之毒性变异快，导致病害的防治一直处于被动状态，因而加快解析条锈菌毒性及其变异机制成为目前亟待解决的重大科学问题。小麦条锈菌是一种专性寄生真菌，必须依赖活体小麦才能生存，主要通过在寄主体内唯一的侵染结构—吸器从寄主细胞内汲取营养物质，与寄主建立寄生关系。细胞学研究表明，侵染时病菌会通过吸器向寄主细胞分泌一些蛋白，调控寄主防御反应发挥毒性功能。然而吸器分泌何种类型的蛋白，分泌蛋白如何进入寄主细胞，进而如何行使其功能等科学问题均不清楚。另外，当分泌到寄主细胞的效应蛋白被抗病蛋白识别时，会引发过敏性细胞坏死（HR），激发寄主的防御反应，发挥其无毒性功能。然而对寄主典型的抗病反应机制—HR的启动、信号传递及坏死的执行等分子事件在小麦与条锈菌互作体系中知之甚少。因而，本论文拟在前期完成的条锈菌基因组测序基础上，系统筛选候选效应蛋白基因，解析效应蛋白基因的毒性和无毒性功能以及鉴定效应蛋白毒性功能结构域和转运结构域；通过实验室构建的cDNA文库筛选可诱导寄主细胞坏死的目标基因，解析其诱发寄主坏死的作用机理以及在条锈菌与小麦互作中的作用。上述研究结果对揭示条锈菌致病机理及寄主的防御机制具有重要的意义，同时对发掘新策略持久控制病害可提供重要的理论依据和技术支撑。主要研究结果如下：1.小麦条锈菌基因组预测获得723个候选分泌蛋白，烟草中瞬时表达筛选得到5个编码未知功能，可抑制由BAX诱导的细胞坏死的分泌蛋白；qRT-PCR分析显示Pst148和Pst9302在侵染早期诱导表达，Pst227在侵染过程中持续诱导表达，Pst8853在侵染早期和后期出现两个诱导表达高峰，Pst82在侵染过程中则呈下调表达，效应蛋白呈现出在条锈菌不同发育阶段多样化的诱导表达模式，表明条锈菌效应蛋白功能的多样性。通过细菌Ⅲ型分泌系统将条锈菌效应蛋白转运到小麦细胞内瞬时表达分析其毒性和无毒性功能，结果表明病菌效应蛋白的表达可抑制寄主细胞坏死和H2O2累积，从而抑制寄主的防御反应；在43个含有不同抗条锈病基因的小麦品系或近等基因系中瞬时表达效应蛋白，结果发现在Yr27近等基因系中Pst8853基因可诱导细胞坏死，表现出无毒性，而其他4个效应蛋白过表达没有检测到明显的细胞坏死。缺失突变体分析发现，Pst82、Pst148、Pst227、Pst9302和Pst8853效应蛋白功能域分别位于成熟蛋白N-末端11-20，1-23、21-40、21-40和21-30位氨基酸，且不含有保守或共同的基序。5个效应蛋白（携带信号肽）的亚细胞定位显示，eGFP融合表达蛋白均定位于烟草细胞内，表明效应蛋白可不依赖于病原菌的存在而被转运到寄主细胞内。同时，序列缺失突变分析发现，负责Pst82、Pst148、Pst227、Pst9302和Pst8853效应蛋白转运的功能结构域分别位于信号肽后40、17、60、30和40个氨基酸内，但白粉菌预测的负责效应蛋白转运的W/Y/FxC基序并不是条锈菌效应蛋白转运所必需的。2.通过烟草瞬时表达系统在小麦-条锈菌互作cDNA文库中筛选到3个可诱导烟草和小麦寄主细胞坏死的目标基因，分别编码未知功能分泌蛋白、腺苷酸转位酶（adeninenucleotide translocase，ANT）和玉米坏死斑点基因（lethal leaf spot1），分别命名为Pst322、PsANT和TaLls1。Pst322，qRT-PCR显示该基因在条锈菌侵染过程中诱导表达，侵染后18h（条锈菌吸器开始形成）表达量最高，推测可能参与条锈菌与寄主互作早期的识别及对寄主防御反应的调控。基因枪轰击小麦进行瞬时表达发现，在携有不同抗条锈病基因的近等基因系和不含抗病基因的对照小麦品系中，Pst322均能激发寄主的细胞坏死；在条锈菌非寄主植物大麦、烟草和拟南芥中瞬时表达Pst322也能够诱导细胞坏死；研究结果表明，在寄主和非寄主植物中，Pst322都具有诱导细胞坏死的功能，可能编码条锈菌激发子，且其激发子活性具有广谱性。通过寄主诱导的病菌基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技术在小麦与条锈菌亲和互作中抑制Pst322的表达发现，Pst322基因沉默后，病菌菌丝生长变慢，菌丝变短，分枝数增加，菌丝扩展面积减少，病菌生长发育明显受抑，表明Pst322除了可诱导寄主的基础防御反应外，在小麦与条锈菌互作中还参与调控条锈菌的生长发育。PsANT，编码蛋白含有三个典型的mito-carr结构域，在动物、线虫及真菌的ANT中高度保守；免疫胶体金结果表明PsANT在正常发育的侵染菌丝及衰老菌丝细胞的线粒体中表达，推测其参与了菌丝正常生长发育所需的能量供给及衰老细胞中细胞凋亡的调控；瞬时表达研究表明，PsANT可诱导细胞坏死，且PsANT三个结构域单独作用均能诱导细胞坏死，但坏死程度弱于两个或三个结构域共同作用，表明PsANT三个结构域不是诱导细胞坏死必需的，但对诱发细胞坏死具有累积效应；qRT-PCR表明，PsANT在条锈菌侵染后24h诱导表达，至48h表达量达到高峰，之后保持较高表达水平。HIGS沉默PsANT基因表达显示，在侵染早期病菌菌丝分支减少，吸器母细胞形成受抑，侵染中期，菌丝变短，分枝数增多，吸器母细胞增多，侵染后期，病菌侵染能力恢复，表明PsANT可能参与能量供应调控条锈菌的生长发育，但并不是条锈菌致病性所必需的。TaLls1，编码脱镁叶绿酸a氧化酶（PaO）；qRT-PCR分析表明，TaLls1在小麦-条锈菌抗病反应中上调表达，但在感病反应中基因表达量没有明显变化；在小麦和烟草中瞬时表达TaLls1基因，可引起红色叶绿素产物RCC（PaO产物）的积累，诱发寄主细胞的坏死，并且当Rieske[Fe-S]结构域发生突变后，TaLls1不能诱发细胞坏死，表明Rieske[Fe-S]结构域是诱导细胞坏死必需的；通过病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）抑制TaLls1基因的表达后发现，TaLls1基因的沉默可导致脱镁叶绿酸a（PaO底物）的积累，从而引致细胞发生坏死，表明在细胞内可能存在一个TaLls1阈值调节寄主的细胞坏死，以适应不同的压力胁迫。TaLls1基因沉默植株接种条锈菌毒性小种CYR31后发现，寄主的细胞坏死频率增加，H2O2累积增多，小麦增强了对条锈菌的忍耐力，表明该基因是小麦抗条锈病的一个负调控因子。