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背景与目的：痛风(gout)是尿酸或尿酸盐(monosodium urate, MSU)结晶沉积于组织或器官引起的一组临床综合征,包括高尿酸血症,痛风性关节炎,痛风性肾病及肾石病。痛风患病率在世界范围内呈逐年上升趋势。流行病学研究显示,欧洲痛风患病率达1.4%,我国山东沿海地区的痛风患病率1.14%。急性痛风性关节炎的一个显著特征是炎症发作一周左右可自发缓解,是痛风区别于其他关节病或自身炎性疾病的显著特征之一,但痛风炎症自限性又易反复发作的确切分子机制目前仍不清楚。研究表明,固有免疫参与了尿酸盐晶体触发痛风炎症反应,其中NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)家族中的核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(TheNACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3. NLRP3)能识别MSU, MSU激活NLRP3炎性体释放出炎症因子IL-1β,体外细胞实验研究发现MSU刺激NLRP3炎性体活化伴随自噬活性增加,自噬又可以通过直接或间接作用负调控NLRP3炎性体限制炎症因子IL-1p的产生,提示自噬可能参与了痛风炎症反应的调控。我国传统中医认为,痛风的病机为脾胃运化功能失常。痛风急性发作期最常见中医证型是湿热蕴结证,治疗以清热利湿解毒为主,而白藜芦醇具有清热解毒、健脾胃的功效。白藜芦醇对胶原诱导大鼠关节炎及骨关节炎均有良好的抗炎效果。研究表明白藜芦醇作为Sirtuin 1 (SIRT1)天然激动剂,白藜芦醇可以激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/SIRT1通路,参与自噬诱导,但其具体机制还不清楚。本课题拟通过研究痛风患者自噬表达变化特点、自噬调控NLRP3炎性体活性以及白藜芦醇调控自噬水平探讨自噬在痛风炎症中的调控作用。材料与方法：1.收集48例急性期(acute gout, AG)、40例间歇期(intercritical gout, IG)痛风患者和同期体检的80例健康对照者(healthy control, HC)者的临床及实验室资料,以及外周静脉血标本；其中间歇期痛风患者6例用于MSU刺激、MSU联合自噬调控剂共刺激和MSU联合白藜芦醇共刺激进行功能研究。2.采用流式细胞术检测间歇期痛风患者外周血经MSU、自噬调控剂、白藜芦醇刺激后的细胞活性。应用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quant itative PCR, RT-qPCR)及western blot检测外周血单个核细胞的beclin-1、LC3、NLRP3、 ASC、SIRT1、IL-1β的基因及蛋白表达水平。采用ELISA检测间歇期痛风患者外周血不同因素刺激后血浆中IL-1p浓度。3.统计分析采用SPSS13.0统计软件包及GraphPad Prism 6进行分析统计,实验数据使用中位数(四分位间距)[M(QR)]或均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(ANOVA)结果,组间两两比较采用t检验,以P<0.05定义为有统计学意义。结果：1.与健康对照者比较,痛风患者除炎症细胞升高外,伴有体重指数、血压、血糖、血脂等多种代谢指标升高(P<0.05或0.01)。2. AG、IG患者的外周血单个核细胞beclin-1 mRNA和蛋白表达水平显著低于正常对照者(P均<0.01),而LC3 mRNA在AG、IG的表达水平显著高于正常对照者(P均<0.01)；LC3-II蛋白水平在AG的表达水平显著高于IG及正常对照者(P均<0.01),IG及正常对照者比较无统计学差异(P>0.05)。3.MSU刺激IG患者外周血1、3小时后beclin-1蛋白水平较无刺激组显著增高(P均<0.01),而MSU刺激6小时后beclin-1蛋白水平较未刺激组则显著降低(P<0.01)。4.IG患者MSU、MSU+自噬激动剂(雷帕霉素)、MSU+自噬抑制剂[3-甲基腺嘌呤(3-MA)、巴佛洛霉素A1 (Baf A1)、E64d+胃蛋白酶A (E64d+pep A)]刺激组LC3-II蛋白水平较空白对照(DMSO、PBS)均显著增强(P均<0.01),MSU、MSU+雷帕霉素组的beclin-1蛋白水平较空白对照组(DMSO、PBS)显著降低(P均<0.01),而MSU+自噬抑制剂组(3-MA、BafA1、E64d+pep A)的beclin-1蛋白水平较MSU、MSU+雷帕霉素组显著升高(P均<0.01)。而正常对照者MSU组、MSU+雷帕霉素组的beclin-1蛋白水平较空白对照组无显著差异(P均>0.05),而MSU+自噬抑制剂组(3-MA、Baf A1、E64d+ pep A)的beclin-1蛋白水平显著低于空白对照、MSU、MSU+雷帕霉素组(P均<0.01)。5.痛风患者NLRP3 mRNA在AG的表达水平显著低于HC(P<0.05), AG与IG,IG与HC间无统计学差异(P>0.05); ASC mRNA在AG的表达水平显著高于IG、HC(P分别<0.01,0.05),IG与HC间无统计学差异(P>0.05)。NLRP3和ASC蛋白水平在AG、IG期显著低于HC(P均<0.01),且IG ASC蛋白水平较AG更低(P<0.05)；AG患者ASC亚型(ASC-b)蛋白水平显著高于IG、 HC(P均<0.01),而且IG的ASC-b较HC显著降低(P<0.05)。6.IG患者在MSU、MSU+雷帕霉素刺激组ASC蛋白水平较空白对照(DMSO)均显著降低(P均<0.01),且MSU+雷帕霉素组较MSU组ASC蛋白水平更低(P<0.01),而MSU+自噬抑制剂组(3-MA、Baf A1 E64d+pep A)的ASC蛋白水平较空白对照、MSU、MSU+雷帕霉素组显著升高(P均<0.01)。7.IG患者空白对照组未能明显检测出caspase-1 p20蛋白表达,MSU刺激组caspase-1 p20蛋白表达水平较空白对照显著升高(P<0.01),而MSU+雷帕霉素组caspase-1 p20表达水平较MSU组显著降低(P<0.01)。MSU、MSU+雷帕霉素组IL-1p蛋白水平较空白对照(DMSO)均显著升高(P均<0.01),并且MSU+雷帕霉素组较MSU组IL-1p蛋白水平降低(P<0.01),而MSU+自噬抑制剂组(3-MA、Baf A1、E64d+pep A)的IL-1p蛋白水平较空白对照、MSU+雷帕霉素组显著升高(P均<0.01)。8.痛风患者SIRT1 mRNA在AG、IG的表达水平显著低于正常对照者(P均<0.05),AG与IG间比较,AG SIRT1 mRNA更低,但无统计学差异(P>0.05)；AG、IG组SIRT1蛋白水平显著低于HC组(P分别<0.01,0.05),AG组SIRT1表达水平显著低于1G组(P<0.01)=200μg/ml和400μg/ml白藜芦醇联合MSU组SIRT1与MSU组比较显著升高(P均<0.01),而100μg/ml白藜芦醇组SIRT1较MSU组有所升高,但无统计学差异(P>0.05)。9.MSU刺激组的beclin-1、LC3 mRNA表达水平较空白对照组显著升高(P均<0.01)；白藜芦醇联合MSU组beclin-1 mRNA与MSU组比较,200μg/ml和400μg/ml白藜芦醇联合MSU组显著减低(P均<0.01)；而白藜芦醇联合MSU组的LC3 mRNA与MSU组比较,随白藜芦醇组浓度增大无显著降低,LC3mRNA保持在较高水平。100μg/ml和200μg/ml白藜芦醇联合MSU组的beclin-1蛋白水平较空白对照组、MSU组显著增高(P均<0.01),400μg/ml白藜芦醇联合MSU组beclin-1蛋白水平与空白对照、MSU组无显著差异(P>0.05)；LC3-II蛋白水平在MSU、不同浓度白藜芦醇联合MSU组均较空白对照组升高(P均<0.01),且随白藜芦醇浓度升高而降低。10.100μg/ml和200μg/ml白藜芦醇联合MSU组的IL-1p前体(IL-1β p31)蛋白水平较MSU组增高(P均0.01),400μg/ml白藜芦醇联合MSU组IL-1p前体低于MSU组(P<0.05),而IL-1 p p17在200μg/ml和400μg/ml白藜芦醇联合MSU组较MSU组显著降低(P均<0.01)。我们也检测了外周血血浆中IL-1p蛋白水平,MSU刺激外周血释放至血浆中的IL-1β较空白对照组显著升高(P<0.01),在200μg/ml和400μg/ml白藜芦醇联合MSU组较MSU组显著降低(P均<0.01)。结论：1. 痛风患者除炎症指标升高外,易伴有高体重指数、高血压、高血糖、高血脂等多种代谢紊乱。2. 急性期痛风患者的自噬水平显著增强,自噬参与了痛风炎症发病机制。3. 痛风患者自噬通量显著增加,自噬通路正常,beclin-1和LC3-Ⅱ均通过自噬溶酶体途径降解。4. 痛风患者通过自噬负调控NLRP3炎性体功能,抑制痛风炎症反应,这可能与痛风炎症自限性相关。5. 白藜芦醇能增强痛风患者SIRT1表达水平,说明SIRT1是白藜芦醇参与抗痛风炎症反应的作用靶点。6. 白藜芦醇增强自噬水平以及抑制炎症因子IL-1β产生,说明白藜芦醇通过增强SIRT1水平调控自噬参与抑制痛风炎症反应。