甲壳类水产食物过敏的发病率逐年攀升,拟穴青蟹(Scylla paramamosain)作为重要的甲壳类水产经济动物之一,其引起的食物过敏性疾病不容忽视。热加工可有效降低单一过敏原的致敏性,但对于青蟹食物基质致敏性影响的研究有待深入。因此探究热加工影响拟穴青蟹肌肉过敏原致敏性及其分子机理,对于低致敏性产品的加工方法研究和保证拟穴青蟹的食用安全性具有重要意义。本研究首先评估3种热加工方式(煮制、蒸制、高温压力处理)对拟穴青蟹肌肉粗蛋白结构、消化酶水解稳定性和免疫结合活性的影响;针对高温压力处理的拟穴青蟹肌肉组织进行模拟胃肠液的连续消化,利用人肠道上皮细胞Caco-2转运模型对消化产物进行转运吸收,采用嗜碱性粒细胞激活试验检测转运产物的致敏性。结果显示,与生鲜青蟹肌肉粗蛋白相比,热加工后的青蟹肌肉粗蛋白的α螺旋含量显著增加,β折叠和β转角含量降低,蛋白稳定性降低;热加工后青蟹肌肉粗蛋白的酶解稳定性下降,消化率升高,酶解产物的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)E结合活性的抑制率降低,热稳定性过敏原的IgG结合能力下降。与煮制和蒸制2种热加工方式相比,高温压力处理对青蟹肌肉粗蛋白免疫结合活性的消减效果最好,其IgE抑制率降低26.66%±2.46%,IgG结合能力下降21.93%±0.83%。此外,高温压力处理后青蟹肌肉组织的纤维束疏松多孔;肌肉组织中过敏原含量和种类明显消减;肌肉组织悬液平均粒径降低,最大吸收峰蓝移,消化率升高,表明包括过敏原在内的青蟹食物基质空间结构被破坏;高温压力处理产物下调了嗜碱性粒细胞CD63和CD203c的表达,下调比例分别为24.23%±0.07%和4.54%±0.17%。针对高温压力处理的拟穴青蟹中5种重要过敏原,即原肌球蛋白(tropomyosin,TM)、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链、肌质钙结合蛋白和磷酸丙糖异构酶,本研究深入分析了青蟹重要过敏原在消化转运过程中免疫结合活性的变化,以及重要过敏原的耐热耐消化表位;着重分析了热稳定性主要过敏原TM结构及致敏性的变化,采用免疫学及生物信息学等方法验证了耐热耐消化且具有致敏性的TM表位肽及其关键氨基酸,以期解析高温压力处理降低拟穴青蟹致敏性的分子机理。结果显示,青蟹过敏原含二硫键、消化酶酶切位点等易被高温压力破坏的位点;与生鲜蟹相比,经高温压力处理及消化转运后,过敏原的IgG结合活性降低,但转运产物中仍存在含线性表位的耐热耐消化肽段,从而保留了过敏原的免疫结合能力。在5种重要过敏原中,TM的热稳定性和消化稳定性较好,其耐热耐消化肽段中所包含的线性表位数量最多,是拟穴青蟹中主要的热稳定性过敏原。进一步的分析显示,高温压力处理后TM的α螺旋被打开,疏水性增强,过敏原的空间构象被改变,致敏性显著降低;吸收转运产物中仍存在7条耐热耐消化且具有致敏性的TM表位肽,分别为AA19-29、39-48、99-109、110-123、153-162、170-188和211-221,且7个关键氨基酸对TM表位肽的IgE结合能力影响较大,分别为R21、E103、E104、E115、A116、E122和E156。在此基础上,本研究采用美拉德反应(5%的L-阿拉伯糖浸渍2 h)结合高温压力复合处理拟穴青蟹,可定向修饰过敏原耐热耐消化表位中糖基化位点,进一步降低了拟穴青蟹的免疫结合活性。综上所述,本研究发现热加工后拟穴青蟹粗蛋白的α螺旋含量增加,纤维束疏松多孔,有利于消化酶与蛋白质的接触,食物中过敏原含量及种类明显减少,致使消化率升高,致敏性降低;高温压力处理破坏了包括过敏原在内的青蟹食物基质空间结构,影响了过敏原中不耐热的表位,进而降低了青蟹肌肉过敏原的致敏性;基于过敏原耐热耐消化表位的糖基化修饰,可进一步降低拟穴青蟹的免疫结合活性。这些研究结果初步解析了热加工降低拟穴青蟹致敏性的分子机理,为低致敏性食品的研发奠定了理论基础,也为全面评估热加工对食物致敏性的影响提供了新思路。