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外源生长素和细胞分裂素在离体条件下可控制风信子花被片外植体定向发生各种花器官。外植体接种于含有2,4-D(0.1mg/L)和6-BA(2.0mg/L)的MS培养基上,花分生组织从外植体上直接发生。该离体再生系统显示出生长素和细胞分裂素在花分生组织的发生中起着决定性作用。本研究利用风信子离体实验系统,从分离生长素和细胞分裂素诱导响应的基因着手,为初步理解两种激素在花发育过程中的作用机理提供新资料。 用在含有外源激素的培养基上培养5天(花分生组织开始形成)和10天(花分生组织已基本形成)的风信子外植体为材料,构建起cDNA文库。 利用cDNA Microarrray技术,经过杂交筛选和EST分析序列分析,最终从cDNA文库中获得了229个不同的外源激素诱导响应的基因序列。经过进一步的筛选,结合序列特征和同源基因的功能信息对这些基因功能进行了初步分析。认为两种外源激素可能通过①泛素/26S蛋白酶体复合体对调节蛋白的降解机制,②生长素运输载体肌动蛋白依赖的小泡运输,③基因转录调节,④磷酸化和去磷酸化等调节过程诱导风信子花分生组织的再生。 利用Northern杂交技术,选择四个基因对其表达进行了初步分析。 外源激素提高HFT基因的表达水平,HFT在外植体接种于含有生长素和细胞分裂素的MS培养基上培养24小时、5天、10天和15天的材料中均表达,并且其表达水平逐渐增高。在植株上,HFT基因在根和叶中高水平表达。结果表明外源激素促进了该基因的表达。 外源激素在短时间内诱导锌指蛋白基因HZF1的高水平表达。风信子HZF1基因在未培养的外植体中表达。当外植体接种于含有生长素和细胞分裂素的MS培养二 樊金会:风信子离体花器官再生系统中激素诱导有匣基因的分离和表达基上24小时,其表达水平显著提高,5天后则不表达或低水平表达。当外植体在天外源激素的培养基上培养时,HZF则低水平表达。在植株上该基因在不同的器官中均表达,但表达水平不同。因此,HZFj在外源激素的作用下,只在较短的时间内表达水平提高,表明该基因是对外源激素响应的早期基回c 环状锌指蛋白基因HRZ在未培养的外植体中表达。当外植体接种于含有外源igi素的 MS培养基上 24小时、5天和 10天时,表达水平维持稳定或略有提高,至15天时,则表达水平下降。HRZ基因在无外源激素的培养基上培养的材料中,表达水平极低。表明外源激素维持或促进了其表达。在植株的不同器官中,HRZ均有不同水平的表达。 外源激素调节GA羟基化酶类似基因的表达时间特性。风信子GA羟基化酶类似基回在外植体表达,在含有外源撒素条件下培养的前5天受到激素的抑制而几乎不表达,第 10天开始在花分生组织中表达。GA羟基化酶为 GA合成的关键酶。