猪细小病毒分离株的生物学特性、基因组序列分析及免疫原性研究

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猪细小病毒病(Porcine Parvovirus Infection,PPI)也称为猪繁殖障碍病,是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)引起的一类以初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎等症状为主要特征的疾病,对各种年龄、性别的猪均易感。该病广泛分布于世界各地并呈地方性流行。近年来,猪场PPV的感染率和PPI的发病率都有不断升高的趋势,给养猪业带来了严重的经济损失。因此,了解PPV的病原学特征、遗传特征及免疫原性为PPV的防控提供参考根据,对养猪业的发展具有重要意义。本研究对临床采集的疑似PPV感染病料进行PCR检测,将检测结果呈阳性的病料经处理后接种猪睾丸细胞(Swine testis cell,ST cell)进行病毒分离,得到1株能在ST细胞上稳定繁殖的毒株,命名为PPV GD-2。对该毒株的理化性质进行鉴定后,发现该毒株对氯仿、酸(pH3.0)和胰蛋白酶不敏感,能耐受56℃水浴30 min,与以往报道的PPV特性相符。根据PPV NADL-2序列设计5对引物,对PPV GD-2的全基因组序列进行扩增后测序,得到涵盖全部编码区的长为4322 bp的近全基因组序列。为了探究PPV毒株的遗传进化特征,本研究利用了基于贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛方法(the Bayesian Markov Chain Monte Carlo method)的beast v1.8.3相关软件进行遗传进化分析,进化树分析表明该毒株与经典弱毒株NADL-2的亲缘关系最近,计算得到PPV VP2基因的平均核苷酸替代率为2.3592×10-5个核苷酸/位点/年(95%HPD:1.1051×10-8,5.1334×10-5),PPV毒株的最近共同祖先(The most recent common ancestor,TMRCA)来源于400多年前的1593年。为了了解PPV GD-2感染ST细胞后的增殖情况以及PPV GD-2的培养特性,本研究建立了特异性强、灵敏度高的PPV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,利用建立的方法对PPV GD-2分离株接种ST细胞后不同时期病毒DNA含量进行分析,根据检测结果绘制出了病毒体外增殖的一步生长曲线,在PPV GD-2感染细胞后8 h,病毒开始大量繁殖,呈指数增长,16 h后,随着细胞病变程度加剧,细胞逐渐裂解死亡,病毒DNA含量减少,最后趋于稳定水平。另外,本研究对PPV GD-2的免疫原性进行了分析。利用对PPV敏感的豚鼠建立动物模型,将PPV GD-2免疫豚鼠后,发现其对豚鼠无致病性,且能较好的刺激机体产生持续性的抗体,表明该分离株具有良好的免疫原性。综上所述,本研究从临床疑似感染PPV的妊娠母猪胎儿体内分离出1株能够在ST细胞稳定增殖的猪细小病毒PPV GD-2,遗传进化分析表明该毒株与PPV NADL-2亲缘关系最近,将该毒株免疫豚鼠后发现其具有良好的免疫原性。
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