高等植物的胚胎发育是植物个体发育的起点,也是植物生活史中非常重要的环节。长久以来,由于各种因素,高等植物早期胚胎发育的研究一直没有得到深入的开展。烟草合子和早期胚胎分离与培养是本实验室传统的优势技术,结合-系列分子生物学方法,本实验室建立了烟草早期胚胎的差减文库,旨在深入研究双子叶植物胚胎发育的分子机理,特别是早期胚胎发育过程中的关键事件,例如合子极性建立,顶、基细胞命运决定,合子和早期胚胎基因激活等等。同时,我们也利用各种细胞生物学方法,例如合子体外培养,细胞器荧光染料定位以及超微结构观察等,分析了烟草早期胚胎发育和极性建立过程中细胞学变化。此外,通过基因表达谱分析结合功能预测,在已建立的烟草早期胚胎差减文库中寻找感兴趣的候选基因；并且采用分子生物学和遗传学等实验手段,对目标基因的生物学功能进行了研究和分析。获得的主要结果如下：1、利用烟草合子体外培养体系,研究了早期胚胎发育及极性建立中阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan Proteins, AGPs)的作用。AGPs是一类在植物生直发育过程中起重要作用的糖蛋白。在本实验室先前的研究中发现,在合子体外音养中添加p-GlcY试剂(一种AGPs的拮抗剂)能影响卵细胞受精以及改变合子第一次细胞分裂的模式,合子由正常的不对称分裂变成均等分裂,暗示AGPs可能参与了烟草受精过程,早期胚胎发育和极性建成。然而,AGPs是如何与其(?)因子相互作用从而参与这些重要的发育过程还不清楚。在本研究中,我们利用己建立的合子体外培养体系,在细胞水平上观察β-GlcY处理对合子和早期胚胎发育的影响。通过AGPs抗体JIM13的免疫荧光定位和β-GlcY染色,我们发现在烟草合子和早期胚胎表面及细胞分裂面上AGPs丰富分布。利用CW(Calcofluor White)荧光染料对纤维素分布进行观察,发现经β-GlcY处理影响了原胚细胞壁纤维素的沉积。利用抗体JIM5和JIM7分别用于检测低酯化和高酯化的果胶,结果表明不同酯化程度的果胶在烟草体内合子和早期胚胎中呈极性分布。利用FM4-64荧光染料观察小泡的分布规律,结果表明β-GlcY处理影响了小泡在细胞板附近的特异分布。此外,通过荧光染料我们观察到β-GlcY处理影响了内质网和线粒体等细胞器的分布。这一系列的细胞学定位结果暗示,AGPs可能参与了细胞分裂过程中细胞板的形成,从而影响了烟草早期胚胎的细胞分裂和形态建成。2、对烟草顶、基细胞差减文库中筛选的RC18基因进行了初步的功能分析。表达分析表明,RC18是基细胞优势表达的基因,该基因在花药以及受精后1天5天和15天的胚珠中有较为特异的表达,而在根、茎、叶中基本没有表达。利用染色体步移法得到该基因的全长序列,通过同源比对后初步确认RC18编码了一种细胞分裂素糖基转移酶,推测它可能在维持细胞分裂素动态平衡过程中起作用。同时,通过构建该基因RNAi载体进行烟草转基因,获得的转基因阳性植株出现了与生殖发育相关的表型。表型分析显示,RC18基因水平下调后,雌雄配子体发育特别是配子体的减数分裂受到影响,导致雌雄配子体败育；在胚胎发育过程中,球形胚的胚柄和胚体细胞分裂异常,胚柄更为明显；心形和鱼雷形胚胎子叶数目和形态也出现一定比例的异常,例如出现三片子叶、不对称子叶和融合子叶等；随后,转基因植株种子萌发和幼苗生长过程中幼苗子叶异常明显可见,与胚胎时期子叶异常相吻合。对烟草早期胚胎发育过程中起到重要作用的糖蛋白AGPs的研究,为深入了解双子叶植物合子不均等分裂和早期胚胎发育的相关机理提供实验数据和信息。对RC18的生物学功能研究将为深入研究该基因作用机理和调控网络提供重要的基础数据。