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目的1.建立HBV复制小鼠模型并研究HBV清除的免疫学机制。2.了解MCMV和HBV先后感染/复制的相互影响及其机制。重点研究合并CMV感染对HBV感染转归的影响。材料和方法1.将10ug腺病毒载体构建的HBV表达质粒pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入不同来源的6-8周的雄性C57BL/6小鼠(Harla、DEREG、ZTL、Charles River)体内,监测不同时间点血清HBsAg清除情况。2.分别将2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入三组Harlan小鼠,监测不同时间点血清HBsAg清除情况。3.将10ugpAAV/HBV1.2及其HBV核心区截短的突变体(HBc150、HBc175)以及质粒骨架和HBV序列长度均不同于pAAV/HBV1.2的质粒pSM2分别经尾静脉高压水注射入3组Harlan小鼠体内。监测不同时间点血清HBsAg清除情况。采用细胞内IFNγ染色结合细胞表面染色技术检测Harlan小鼠在分别转染pAAV/HBV1.2和pSM2后不同时间点外周血单个核细胞中HBV特异的T细胞的数量。4.将10ug的pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入Harlan小鼠,6周后经腹膜内注射100ul含5×104PFU的MCMV病毒。检测不同时间点血清HBsAg水平。在MCMV感染1周后制备脾脏淋巴细胞悬液用于检测MCMV及HBV特异性T细胞。匀浆肝脏组织,收集上清采用病毒空斑试验检测MCMV的滴度。5.分别对HBV和MCMV免疫的脾脏和肝脏细胞作细胞内因子染色和抗原肽包被的H-2b二聚体和五聚体染色,以检测HBV与MCMV之间是否存在交叉免疫细胞。6.将100ul含1×105PFU MCMV的PBS经腹膜内注射入Harlan小鼠体内,6周后经尾静脉高压水注射10ug pSM2质粒。检测不同时间点血清HBsAg水平。pSM2注射后16天制备脾脏淋巴细胞悬液用于检测MCMV及HBV特异性T细胞及NK细胞、Treg细胞的频率。匀浆肝脏组织,收集上清采用病毒空斑试验检测MCMV的滴度。7.分别采用针对NK细胞、CD8细胞以及INF-γ的单克隆抗体在pSM2转染小鼠前后经腹膜内注射入小鼠体内。监测血清HBsAg水平及HBV特异性T细胞应答强弱的变化。结果1.不同来源的C57BL/6J小鼠在pAAV/HBV1.2转染后1天可检测到血清中HBsAg分泌,第4天到1周达到最高峰,随后逐渐下降,所有Harlan小鼠和DEREG小鼠血清HBsAg分别于第6周和第7周下降至检测限以下。而50%的ZTL小鼠及Charles River小鼠HBsAg血症持续到8周以后。2.三组分别转染了2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2的Harlan小鼠均在质粒注射后5周内清除了HBsAg血症,清除过程没有显著性差别。3.75%转染pAAV/HBV1.2的Harlan小鼠在质粒注射后4周内清除血清中的HBsAg,而66%转染HBc150及HBc175的小鼠分别在质粒注射后第3周和5周清除血清中的HBsAg o所有转染pSM2的小鼠在注射质粒后2周内HBsAg血症消失。4.pSM2转染后第2周起,在Harlan小鼠PBMC中即可检测到针对HBcAg和HBsAg的特异性免疫应答,其中针对HBcAg的免疫应答显著高于HBsAg。而在pAAV/HBV1.2及其衍生质粒转染的小鼠PBMC中未检测到HBV特异性免疫应答。5.急性HBV清除后的小鼠和未经免疫的小鼠在感染急性MCMV后产生MCMV特异性的T细胞数量以及肝脏中MCMV的病毒含量无显著性差别。急性HBV感染后第7周,血清中HBsAg清除后第2周,在MCMV感染的小鼠而非HBV转染小鼠的脾脏中检测HBV抗原的特异性T细胞应答。采用抗原肽包被的H-2b二聚体和五聚体染色技术在MCMV免疫的脾脏细胞中检测到能同时与HBV抗原肽C1与MCMV抗原肽M57反应的T细胞,在HBV免疫的脾细胞中则未检测到,说明这种交叉免疫具有单向性。6.持续性MCMV感染或未经免疫的Harlan小鼠转染pSM2后,其血清HBsAg水平迅速上升,4天后达到最高峰,以后逐渐下降。持续性MCMV感染的小鼠血清HBsAg清除较缓慢,血清HBsAg水平在转染pSM2后第9、11天均高于未经免疫的小鼠。在9天时有显著性差异。转染pSM2后,两组小鼠未检测到巨噬细胞(F4/80) MHC表达量的显著差异。但是在持续性MCMV感染的小鼠中产IFNy的HBV C1特异性T细胞及NK细胞显著高于未经免疫的小鼠。清除或封闭NK细胞或EFNγ均可增加血清HBsAg水平,同时封闭IFNy还可减低HBV特异性T细胞数量。另外转染pSM2后,持续性MCMV感染小鼠脾脏和肝脏内Treg细胞数量显著高于未经免疫的小鼠。7.持续性MCMV感染的小鼠转染pSM2后,其脾脏中针对MCMV特异性的T细胞数量及肝脏中MCMV的病毒含量较单纯持续性MCMV感染的小鼠无显著性差异。结论1.HBV表达质粒的质粒骨架、HBV序列组成以及小鼠的基因背景决定了HBV在小鼠体内持续时间。其中基因背景的差异普遍存在,来源不同的同品系小鼠清除HBV的能力各不相同。HBV特异性T细胞应答是HBV清除的重要机制,其强弱决定了HBsAg血症持续时间的长短。2.既往的HBV感染对急性MCMV感染的结局和免疫状态没有显著影响。但是持续性MCMV感染对急性HBV复制的免疫状态和结局有显著影响：一方面MCMV记忆细胞能够单向提供对HBV感染的抵抗作用(散发)；另一方面MCMV感染可通过降低的NK细胞和HBV特异性T细胞数量,进而减少IFNy分泌,最终导致HBV的清除减慢。这种现象可能与MCMV感染小鼠中升高的Treg细胞对HBV特异性免疫应答的负性调控有关。继发急性HBV复制对持续性MCMV清除无影响本研究的创新点1.pAAV/HBV1.2经尾静脉高压水注射入C57BL/6J小鼠建立的慢性HBV复制模型已经被广泛认识,但在科学实践中,往往不能成功复制该模型。本研究表明除了小鼠的品系外其来源不同也会影响到HBV持续状态。2.首次利用高压水尾静脉注射小鼠的HBV复制模型和MCMV感染模型来模拟人类HBV和CMV共感染对机体抗病毒免疫功能以及感染结局的影响。本研究的意义既往的研究表明病毒感染结局取决于宿主的遗传背景和病毒致病力,我们的研究表明个体既往的感染病史可对新的病毒感染结局产生影响。本研究建立了MCMV和HBV共感染的小鼠模型,并在此基础上研究了MCMV感染与急性HBV复制之间相互影响及可能的免疫学机制。这些工作拓宽了我们对HBV自然感染状态下(没有一个个体是未经免疫的)机体对HBV的免疫应答和清除机制的认识。另外,我们的研究结果提示在设计疫苗时应当考虑异种免疫对新病原体感染的抵抗作用以及对感染结局的影响。