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从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选出一条438 bp的基因序列(基因登录号:EU826676),编码150个氨基酸残基,序列比对发现是NDUF-b5家族的一个亚基,将该基因命名为BmNADHb5(Bombyx mori Nicotinamide adenine dinucleotide hydridecyto-chrome b5 reductase)。
目的片段经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后插入到高效表达载体pET-28a(+)中,成功构建原核表达载体pET-28a(+)-BmNADHb5,在E.coli Rosetta中过度表达重组的pET-28a(+)-BmNADHb5并纯化蛋白。超声破碎表达产物,发现以包涵体的形式存在于沉淀中,我们通过镍柱进行纯化,以纯化的融合蛋白为抗原多次免疫一只雄性新西兰兔,获得的抗体用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测得其效价为1:12800以上。我们提取了家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个时期的总蛋白和总RNA,又选择五龄幼虫第三天作为实验对象来研究BmNADHb5的组织分布情况,提取了家蚕的头、表皮、马氏管、气管、脂肪体、丝腺、睾丸和卵巢等组织的总蛋白和总RNA。我们用ELISA半定量法和Western blit以及荧光定量PCR实验检测BmNADHb5的表达分析及其分布。ELISA半定量法和Western blot技术分析发现BmNADHb5蛋白在家蚕各发育时期都有表达,其中卵期表达量明显高于其他发育时期,在各组织中,气管、生殖器等表达量较高。荧光定量PCR实验,我们发现家蚕各发育时期,蛹期表达量明显高于其他发育时期,在各组织中,马氏管表达量最高。我们又用免疫荧光技术对BmNADHb5蛋白在家蚕卵巢上皮细胞BmN进行定位研究,结果发现,它在细胞整个生长周期中主要存在于细胞质中。该结果为我们进一步研究BmNADHb5蛋白在细胞中的功能奠定了基础。