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第一部分:miR-361-3p在成牙骨质细胞分化过程中的表达和影响实验目的阐明成牙骨质细胞分化过程中miRNAs的表达模式,筛选出可能调控成牙骨质细胞分化的差异表达miRNAs;研究筛选出来的差异表达miRNA对成牙骨质细胞分化的影响材料与方法1.成牙骨质细胞OCCM-30矿化诱导分化:使用矿化诱导液（DMEM培养基+5%FBS+10m Mβ-甘油磷酸钠+50μg/ml抗坏血酸+0.01μM地塞米松）对成牙骨质细胞系OCCM-30进行培养。2.miRNA微阵列分析实验:分别在矿化诱导的第0、3、14、21天收集OCCM-30细胞,进行miRNA微阵列分析实验;将芯片数据按照时间序列进行差异分析,筛选出OCCM-30细胞分化过程中差异表达的miRNAs,并进行生物信息学分析。3.q RT-PCR验证miRNA微阵列实验结果:使用矿化诱导液培养OCCM-30细胞,第0、4、7、14天收集样品,q RT-PCR检测miR-361-3p和矿化标志基因Osx、Bsp、Bglap的m RNA表达变化。4.使用慢病毒包装系统建立稳定过表达或沉默miR-361-3p的OCCM-30细胞系,q RT-PCR检测过表达或沉默miR-361-3p的效果。5.利用q RT-PCR、Western blot、ALP染色、ALP活性定量检测、茜素红染色鉴定过表达或沉默miR-361-3p对OCCM-30细胞分化能力的影响。结果1.miRNA微阵列分析实验检测到OCCM-30细胞矿化过程中差异表达的miRNAs总共336个;结合生物信息学分析,本研究重点关注了在OCCM-30细胞矿化过程中表达量显著下降的miR-361-3p。2.q RT-PCR结果验证了miRNA微阵列分析实验中miR-361-3p的表达变化,即随着OCCM-30细胞矿化诱导时间的延长,标志基因Osx、Bsp和Bglap的表达显著升高,而miR-361-3p的表达量逐渐下降,与矿化呈现负相关。3.与对照组相比,过表达组的miR-361-3p表达显著升高超过了20倍;与对照组相比,沉默组中miR-361-3p的预测靶基因Nfat5和Ogt均显著升高,表明miR-361-3p-sponge发挥了吸附作用,成功沉默了miR-361-3p。4.过表达miR-361-3p明显抑制了OCCM-30细胞分化相关基因Osx、Bsp和Bglap的m RNA和蛋白表达,而沉默miR-361-3p后,Osx、Bsp和Bglap的m RNA和蛋白水平显著提高。5.ALP染色和ALP活性定量实验结果显示,与对照组相比,过表达miR-361-3p导致OCCM-30细胞在矿化诱导4天后ALP染色深度和ALP活性都明显下降,而沉默miR-361-3p则促进了OCCM-30细胞染色深度的加深和ALP活性的增强;茜素红染色结果显示,与对照组比较,过表达miR-361-3p抑制了OCCM-30细胞矿化结节的形成,而沉默了miR-361-3p之后,OCCM-30细胞形成了更多的矿化结节,矿化程度变强。结论1.miR-361-3p在成牙骨质细胞分化过程中表达水平显著下调;2.过表达miR-361-3p抑制了成牙骨质细胞分化的能力,而沉默miR-361-3p后则明显增强了成牙骨质细胞分化的能力。第二部分:miR-361-3p在成牙骨质细胞中靶向负性调节转录因子Nfat5的表达及机制实验目的筛选miR-361-3p在成牙骨质细胞中的靶向调节基因;明确靶基因在成牙骨质细胞中的表达和定位;研究miR-361-3p与靶基因在成牙骨质细胞分化过程中的功能联系。材料与方法1.靶基因筛选:通过miRNA靶基因预测的综合数据库DIANA Tools结合NCBI,MGI（Mouse Genome Informatics）以及Ensembl进行生物学分析和预测,挑选感兴趣的miR-361-3p候选靶基因,并通过q RT-PCR和Werstern blot进行验证和筛选。2.双荧光素酶实验验证靶基因:生物信息学分析候选靶基因Nfat5 m RNA3’UTR中miR-361-3p的结合位点,选取其中一个保守位点的序列构建野生型和突变型的Nfat5 3’UTR双荧光素酶报告质粒。将Nfat5 3’UTR野生型/突变型报告质粒分别与miR-361-precursor（miR-361-3p过表达质粒）/miR-361-3p-sponge（miR-361-3p沉默质粒）/miR-CTL（对照质粒）共转染OCCM-30细胞,转染48小时后检测荧光素酶活性。3.q RT-PCR和Western blot检测OCCM-30细胞矿化过程中Nfat5的m RNA和蛋白的表达趋势。4.免疫荧光实验和免疫组化实验检测NFAT5在体外和体内成牙骨质细胞中的表达和定位。5.建立稳定敲低Nfat5的OCCM-30细胞系,q RT-PCR、Werstern blot、ALP染色、ALP活性定量检测、茜素红染色鉴定敲低Nfat5对OCCM-30细胞分化能力的影响。6.Western blot检测敲低Nfat5对OCCM-30细胞分化过程中一些对细胞增殖、分化有重要功能的信号通路的影响,包括Erk1/2 MAPK、JNK MAPK、p38 MAPK、PI3K-Akt、NF-κB以及Wnt/β-catenin信号通路。结果1.靶基因筛选:通过生物学信息分析和相关研究报道,我们挑选了8个感兴趣的miR-361-3p的候选靶基因,通过q RT-PCR和Werstern blot验证和筛选,将候选靶基因Nfat5作为研究重点;q RT-PCR和Werstern blot结果显示过表达miR-361-3p后,OCCM-30细胞中Nfat5的m RNA和蛋白表达量显著下降;沉默miR-361-3p后,Nfat5的m RNA和蛋白表达量显著上调。2.双荧光素酶实验验证靶基因:与对照组相比,miR-361-precursor显著抑制了Nfat5 3’UTR野生型报告质粒的转录活性,但对突变型报告质粒的转录活性无明显影响;而miR-361-3p-sponge则明显促进了Nfat5 3’UTR野生型报告质粒的转录活性,同时对突变型报告质粒的转录活性也无明显影响;双荧光素酶活性检测实验证明了Nfat5是miR-31-3p的直接靶基因。3.Nfat5在OCCM-30细胞矿化过程中的表达模式:随着OCCM-30细胞自然矿化时间的加长,Nfat5的表达量逐渐升高,与miR-361-3p的表达趋势相反。4.NFAT5的表达和定位:免疫组化结果显示大鼠磨牙根尖区的成牙骨质细胞表达NFAT5;免疫荧光和免疫组化结果显示NFAT5主要定位在成牙骨质细胞核中,同时也有部分定位在细胞质中。5.Nfat5对OCCM-30细胞分化的影响:沉默Nfat5抑制了OCCM-30细胞分化相关基因Osx、Bsp和Bglap的m RNA水平和蛋白水平的表达;沉默Nfat5后,OCCM-30细胞矿化过程中ALP染色变浅,ALP活性显著下降,矿化结节形成数量明显减少。6.Nfat5对信号通路的影响:Western blot结果显示,与对照组相比,沉默Nfat5后,OCCM-30矿化第4天p-Erk1/2、p-JNK、p-p38、p-Akt、p-p65的蛋白量均升高,而β-catenin蛋白量下降,说明了OCCM-30细胞矿化过程中,沉默Nfat5激活了Erk1/2、JNK、p38、PI3K-Akt和NF-κB信号通路,抑制了Wnt/β-catenin信号通路。结论1.转录因子Nfat5是miR-361-3p在成牙骨质细胞中的直接靶基因;2.敲低Nfat5后能够模拟过表达miR-361-3p对成牙骨质细胞分化的抑制作用;3.Nfat5影响多条重要的信号通路:成牙骨质细胞分化过程中,敲低Nfat5激活了Erk1/2、JNK、p38、PI3K-Akt和NF-κB信号通路,抑制了Wnt/β-catenin信号通路。第三部分:miR-361-3p/Nfat5轴调控成牙骨质细胞分化的信号转导机制研究实验目的检测miR-361-3p/Nfat5轴调控成牙骨质细胞分化的信号转导机制材料与方法1.将过表达或沉默miR-361-3p的OCCM-30细胞诱导分化,第4天提取细胞总蛋白,Western blot检测在细胞增殖、分化过程中发挥重要功能的信号通路的变化,包括Erk1/2 MAPK、JNK MAPK、p38 MAPK、PI3K-Akt、NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路。2.双荧光素酶实验:将Wnt/β-catenin信号通路的报告质粒Topflash或Fopflash+内参质粒p RL-TK分别转入稳定转染miR-361-precursor或miR-361-3p-sponge或miR-CTL的OCCM-30细胞中,转染48小时后检测荧光素酶的转录活性。3.信号通路回复实验:分别将Erk1/2、JNK、p38、PI3K-Akt、NF-κB信号通路特异性的化学阻断剂和Wnt/β-catenin信号通路的化学激动剂按工作浓度溶于矿化诱导液中,对过表达miR-361-3p的OCCM-30细胞进行培养;过表达miR-361-3p和对照组miR-CTL的OCCM-30细胞的矿化培养基中加入相同剂量的DMSO作为对照。矿化诱导第四天,q RT-PCR检测分化相关基因Osx、Bsp和Bglap的m RNA表达变化。结果1.Western blot结果显示,与对照组相比,过表达miR-361-3p后,OCCM-30细胞矿化第4天p-Erk1/2、p-JNK、p-p38、p-Akt和p-p65的蛋白量均升高了,而β-catenin蛋白量下降,说明了OCCM-30细胞矿化过程中,过表达miR-361-3p激活了Erk1/2,JNK、p38、PI3K-Akt、NF-κB信号通路,抑制了Wnt/β-catenin信号通路;沉默miR-361-3p则抑制了Erk1/2、JNK、p38、PI3K-Akt和NF-κB信号通路,激活了Wnt/β-catenin信号通路;这些实验结果与敲低Nfat5后对这些信号通路的影响一致。2.双荧光素酶实验进一步证实了miR-361-3p对Wnt/β-catenin信号通路的影响:在OCCM-30细胞分化过程中,过表达miR-361-3p抑制了Wnt/β-catenin信号通路报告系统的转录活性,而沉默miR-361-3p则显著提高了报告系统的转录活性。3.与单纯进行矿化诱导液培养的过表达miR-361-3p的OCCM-30细胞相比,抑制了Erk1/2信号通路后,消除了过表达miR-361-3p对Osx表达的抑制作用,Osx的m RNA表达显著升高;抑制了JNK信号通路后,进一步加强了miR-361-3p对Osx表达的抑制作用,但是却使Bsp和Bglap的m RNA表达大幅度升高;抑制了p38信号通路后,显著加强了过表达miR-361-3p的抑制作用,使Osx、Bsp和Bglap的m RNA表达全部明显下调;抑制了PI3K-Akt信号通路后,明显削弱了过表达miR-361-3p对OCCM-30细胞分化的抑制作用,Osx和Bglap的m RNA表达明显升高,Bsp的m RNA表达也有所回复;抑制了NF-κB信号通路和激活Wnt/β-catenin信号通路后,均使Osx和Bglap的m RNA表达进一步降低,但却提高了Bsp的m RNA表达水平。结论1.多种信号通路参与miR-361-3p对成牙骨质细胞的分化调控:成牙骨质细胞分化过程中,过表达miR-361-3p激活了Erk1/2、JNK、p38、PI3K-Akt和NF-κB信号通路,抑制了Wnt/β-catenin信号通路,与敲低Nfat5结果一致,而沉默miR-361-3p后则结果相反。2.miR-361-3p/Nfat5通过或部分通过Erk1/2和PI3K-Akt信号通路调控成牙骨质细胞的分化,JNK、p38、NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路在其中起稳态平衡作用。