研究背景在晚期肺腺癌领域中,近年最重要的进展是肿瘤驱动基因及分子靶向治疗的研究。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因是肺腺癌的经典驱动基因,对于晚期或不可手术切除的肺腺癌,EGFR基因突变检测已成为临床治疗方案选择的重要依据。研究发现,EGFR基因状态也可能影响肺腺癌患者的化疗疗效。多项研究认为,EGFR突变型较野生型肺腺癌患者更能从化疗中受益,EGFR突变型晚期肺腺癌患者的生存期明显延长。然而,也有研究者得出不同结论,有学者指出EGFR突变型与野生型晚期肺腺癌患者的化疗有效率并无明显差异,并且EGFR突变并没有给患者带来生存期的获益,还在学者观察至EGFR野生型晚期肺腺癌患者的生存期可能更长。由此可见,EGFR基因突变是否能给患者带来化疗有效率及生存期的获益,研究结论尚未统一,仍然需要更多的循证医学证据。有研究者发现,EGFR基因突变可能与DNA修复系统存在某种关联,而DNA修复系统是参与化疗耐药的重要因素。由此推断,EGFR基因突变状态影响化疗疗效的分子机理,可能与DNA修复系统或化疗耐药有关。以铂类为基础的两药联合方案是晚期肺腺癌患者的标准化疗方案,其中紫杉醇联合铂类是最常用的治疗手段。紫杉类的主要作用靶点是p-微管蛋白,多项研究表明,β-微管蛋白Ⅲ(class Ⅲ beta-tubulin, TUBB3)蛋白表达水平与非小细胞肺癌紫杉醇化疗疗效及预后呈负相关。铂类通过诱导DNA损伤产生细胞毒作用,研究发现,核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementing 1, ERCC1)和乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)表达产物在DNA损伤修复通路中起到至关重要的作用。多项临床研究证实,ERCC1或BRCA1基因低表达,患者更容易从铂类为基础的化疗中获益。基于以上研究,本课题以EGFR野生型肺腺癌A549细胞与EGFR突变型肺腺癌HCC827细胞为研究对象,比较紫杉醇和顺铂对两种细胞杀伤作用的差异,并探讨相关的分子机理,在细胞水平论证了EGFR基因突变状态与肺腺癌化疗疗效之间的关系;在临床研究中,对56例接受紫杉类联合铂类一线化疗的晚期肺腺癌患者进行回顾性分析,探讨了EGFR突变状态对晚期肺腺癌患者一线化疗疗效的影响,为晚期肺腺癌化疗疗效的预测提供了进一步依据。第一章紫杉醇和顺铂对EGFR野生型与突变型肺腺癌细胞杀伤作用比较及分子机理探讨目的比较紫杉醇和顺铂对EGFR野生型肺腺癌A549细胞与突变型HCC827细胞杀伤作用的差异及两种细胞中化疗相关基因的表达差异,探讨化疗相关基因表达水平与EGFR突变状态的关系及其对化疗疗效的影响方法1.采用MTT法分别检测紫杉醇、顺铂对肺腺癌A549与HCC827细胞的24h半数抑制浓度(IC50)。2.相同浓度的紫杉醇、顺铂分别单独及联合作用于A549与HCC827细胞,比较其对两种细胞杀伤作用的差异,应用金氏公式判断联合用药指数(Q)。3.采用实时荧光定量PCR法检测紫杉醇、顺铂作用前后A549与HCC827细胞化疗相关基因(BRCA1、ERCC1、TUBB3)的表达水平。4.统计学方法：采用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有统计学数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用两独立样本t检验比较紫杉醇、顺铂对两种细胞杀伤率的差异,采用配对样本t检验比较用药前后化疗相关基因表达的差异。所有统计分析均采用双侧概率检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.紫杉醇和顺铂的24h半数抑制浓度(IC50)紫杉醇对A549与HCC827细胞的IC50分别为100μg/ml、70μg/ml,顺铂对A549与HCC827细胞的IC50分别为40μg/ml、50μg/ml。2.紫杉醇、顺铂单独作用对两种细胞杀伤作用比较相同浓度紫杉醇(100μg/ml)对A549与HCC827的杀伤率(%)分别为47.33±3.79、69.33±2.08,紫杉醇对HCC827细胞杀伤作用更高(P=0.001)；相同浓度顺铂(40μg/ml)对A549与HCC827细胞的杀伤率(%)分别为51.67±1.53、42.00±4.58,顺铂对A549细胞杀伤作用更高(P=0.026)。3.紫杉醇联合顺铂对两种细胞杀伤作用比较紫杉醇联合顺铂对A549与HCC827细胞的杀伤率(%)分别为82.00±5.33、88.96±1.87,两药联合对A549与HCC827细胞的杀伤作用无明显差异(P=0.100),药物联合作用Q值分别为1.03、1.06,对两种细胞均表现为相加作用。4.化疗相关基因表达比较两种细胞在药物作用前比较,HCC827细胞BRCA1基因表达明显高于A549细胞(P=0.021), ERCC1及TUBB3基因表达无明显差异(P=0.317；P=0.115)。顺铂作用于A549细胞后,ERCC1基因表达明显升高(P=0.010),而BRCA1及TUBB3基因表达无明显变化(P=0.904；P=0.417)。紫杉醇作用于A549细胞后,ERCC1、 BRCA1与TUBB3三种基因表达变化均无明显变化(P=0.516；P=0.434；P=0.417)。顺铂作用于HCC827细胞后,三种基因表达均无明显变化(P=0.962,P=0.873,P=0.615)。同样,紫杉醇作用于HCC827细胞后,三种基因表达也无明显变化(P=0.556；P=0.673；P=0.582)。结论1.紫杉醇、顺铂单独作用时,紫杉醇对EGFR突变型肺腺癌细胞杀伤作用更强,顺铂对EGFR野生型细胞杀伤作用更强,而EGFR突变型细胞BRCA1基因表达明显高于EGFR野生型细胞。由此推断,肺腺癌细胞BRCA1基因高表达时,可能对顺铂敏感性低而对紫杉醇敏感性高。2.顺铂作用后,EGFR野生型肺腺癌细胞ERCC1基因表达增加,EGFR突变型细胞ERCC1表达无变化,而ERCC1是顺铂的耐药基因,表明EGFR野生型比突变型肺腺癌细胞更容易对顺铂产生耐药。3.紫杉醇联合顺铂对EGFR野生型与突变型肺腺癌细胞的杀伤作用并无明显差异。第二章EGFR突变型与野生型晚期肺腺癌患者一线化疗疗效观察目的比较表皮生长因子受体(EGFR)突变型与野生型晚期肺腺癌患者的一线化疗疗效,探讨EGFR基因突变对晚期肺腺癌患者化疗疗效的影响。方法1.收集2010年1月1日至2015年5月31日在南方医科大学附属郑州人民医院接受治疗且病理学与EGFR基因状态明确的IIIB/IV期肺腺癌患者56例,所有病例均接受紫杉类联合铂类一线化疗。分析EGFR基因突变状态与晚期肺腺癌患者临床特征的关系,比较EGFR突变型与野生型患者的客观有效率(objective response rate, ORR)、疾病控制率(disease control rate, DCR)及无进展生存期(progression free survival, PFS)等研究终点的差异。2.统计学方法：应用SPSS 17.0进行统计分析。采用Pearson x2检验或Fisher’s确切概率法分析EGFR基因状态、临床特征与化疗疗效之间的关系,采用Kaplan-Meier生存曲线分析PFS,并进行Log-Rank检验,采用Cox回归进行多因素分析。所有统计分析均采用双侧概率检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.病例资料2010年1月1日至2015年5月31日接受治疗的晚期肺腺癌患者中,符合入组标准的有56例,其中男性32例(57.1%),女性24例(42.9%)；全部患者的中位年龄为53周岁(36-75周岁)；年龄<65周岁46例(82.1%),≥65周岁10例(17.9%)；IIIB期5例(8.9%),Ⅳ期51例(91.1%)；PS 0-1分54例(96.4%),PS 2分2例(3.6%)；不吸烟者32例(57.1%),吸烟者24例(42.9%)；EGFR突变型19例(33.9%),EGFR野生型37例(66.1%)。EGFR突变组与野生组患者的年龄、临床分期及PS评分均无统计学差异(P>0.999；P=0.846；P=0.544),而女性患者的EGFR突变率高于男性患者(P=0.028),不吸烟者的EGFR突变率高于吸烟者(P=0.018)。2.EGFR基因突变组与野生组的晚期肺腺癌患者ORR与DCR比较根据RECIST评价标准,入组56例患者中,CR 0例,PR 21例(37.5%),SD20例(35.7%),PD 15例(26.8%),则ORR为37.5%,DCR为73.2%。EGFR突变组患者中,PR 10例(52.6%),SD 5例(26.3%),PD 4例(21.1%),则ORR为52.6%,DCR为78.9%。EGFI野生组患者中,PR 11例(29.7%),SD 15例(40.5%),PD11例(29.7%),则ORR为29.7%,DCR为70.3%。EGFR突变组与野生组患者的ORR无统计学差异(P=0.094),且性别、年龄、临床分期、PS评分及是否吸烟与ORR无关(P=0.577；P=0.368；P>0.999；P=0.523；P=0.577). EGFR突变组与野生组的DCR无统计学差异(P=0.384),且性别、年龄、临床分期、PS评分及是否吸烟与DCR无关(P=0.384；P>0.999；P>0.999；P=0.468；P=0.384).3.EGFR基因突变组与野生组的晚期肺腺癌患者PFS比较随访至2015年12月31日截止,56例患者的中位PFS为4.9个月,EGFR突变组与野生组的中位PFS分别为6.0个月与3.5个月,EGFR突变组的PFS明显延长(P=0.001)。此外,年龄<65与≥65周岁患者的中位PFS分别为5.4个月与3.9个月,<65周岁患者的PFS明显延长(P=0.009)。PS评分0-1分与2分患者的中位PFS分别为5.1个月与0.7个月,PS评分0-1分患者的PFS明显延长(P<0.001),而性别、临床分期及是否吸烟对PFS的影响无统计学意义(P=0.442；P=0.449；P=0.275)。多因素分析显示,EGFR突变状态是影响患者PFS的独立因素(HR=0.309,95%CI:0.150-0.637,P=0.001)。结论EGFR基因突变对晚期肺腺癌患者紫杉类联合铂类一线化疗的ORR及DCR无明显影响,但EGFR突变型患者的PFS较野生型患者明显延长,EGFR突变是影响晚期肺腺癌患者一线化疗PFS的独立因素。