一、研究背景肝细胞癌是一种肝脏原发的恶性肿瘤,其发病率居世界第五,而死亡率已经排在全世界癌症死亡原因的第三位。先天性的遗传改变和后天的高危因子例如HBV/HCV的感染、肝硬化、酒精性肝病及黄曲霉素的污染等都是导致肝细胞癌高发的危险因素。肝细胞癌经常发生在已经病变的肝脏,并且是肝硬化的一个致命的并发症。对肝脏致癌原理研究的缺乏,以及对恶性转化阻断或逆转的失败,导致了肝细胞癌病人的不良预后。临床上针对肝细胞癌的分子靶向治疗急需关键的信号通路。全基因组表达微阵列分析已经找出了导致失控性生长和异常生存信号的一些重要通路,而部分关键通路已经被验证。但是,还没有有意义的基因标记或预后指标进入到临床实践,因此需进一步研究和寻找肝细胞癌新的诊断及预后标记物。已有研究表明细胞周期检查点的破坏在肝细胞癌中是一个重要事件并且能促进肿瘤形成。丝裂原调控子20(Cdc20)是一个细胞周期检查点的调控因子,它和另一个调控因子Cdh1都可直接结合并激活有丝分裂后期促进复合物APC,在细胞进入分裂后期和退出有丝分裂过程中起重要作用。近期,越来越多的研究表明Cdc20是一个致癌因子,在多种人类恶性肿瘤中广泛表达上调,包括胰腺导管腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌及胃癌等,并且与多种肿瘤的不良预后密切相关。但是Cdc20在肝细胞癌中的研究还非常有限,其表达情况及发挥的作用和作用机制还并不十分清楚。二、研究目的检测Cdc20在肝细胞癌组织中的表达情况,探讨其在肝癌发生、发展中的作用及其与肝癌病人预后的相关性,并初步探索Cdc20在肝癌中的分子机制。三、研究方法1.生物信息学分析用生物信息学方法分析公共基因表达数据库GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中GSE14520芯片数据并筛选出肝癌和正常肝组织的差异表达基因,对这些基因进行GO功能分类和KEGG信号通路分析,并构建相互作用网络图,筛选出在肝癌中起重要作用的靶基因。2.靶基因Cdc20在肝细胞癌组织中的表达验证用荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测16对新鲜肝癌组织及癌旁正常肝组织中Cdc20的mRNA和蛋白水平。3.Cdc20与肝癌病人的临床病理参数及预后的关系用免疫组化法在132例肝癌病人的癌组织及癌旁正常肝组织石蜡切片中检测Cdc20的表达情况及表达部位,并分析其表达水平与临床病理参数及总生存率的关系。4. SiRNA干扰Cdc20的表达并检测沉默后对肝癌细胞生长、细胞周期、细胞迁移及下游底物的影响在HepG2细胞系中用siRNA沉默Cdc20的表达,用细胞增殖曲线观察基因沉默后对细胞生长速度的影响,流式细胞仪检测细胞周期的改变,划痕实验检测细胞迁移能力的改变。并用western blot检测了其下游底物p21的表达改变。四、研究结果1.Cdc20是肝细胞癌分子作用网络中重要的靶基因用生物信息学方法筛选出了137个肝癌中的差异表达基因并构建了相互作用基因网络图,Cdc20在网络图中居于中心位置并与多个基因有相互作用,推测其可能是肝癌中重要的靶基因。2.Cdc20在肝细胞癌组织中高表达Cdc20的mRNA及蛋白水平在多数肝癌组织中均表达上调(14/16)。3.Cdc20高表达与多项临床病理参数相关免疫组化检测Cdc20在肝癌组织中表达明显高于癌旁正常肝组织(P=0.000),表达部位主要位于细胞核和细胞质中,并且其高表达与肿瘤的不良分化(P=0.002)及TNM分期相关(P=0.022)。4.Cdc20是肝细胞癌的不良预后因子分析132例病人中75例患者的总生存时间,5年总生存率为21%。Cox回归分析发现Cdc20表达分值(P=0.011)、肿瘤大小(P=0.000)、转移(P=0.006)、AFP水平(P=0.032)、肿瘤分化(P=0.000)、TNM分期(P=0.003)、P53(P=0.02)及Ki67(P=0.004)的表达均与肿瘤的不良预后相关,但只有肿瘤大小(P=0.000)、肿瘤分化(P=0.000)及P53的表达水平(P=0.000)为肝细胞癌独立的预后因子。5.Cdc20表达抑制后细胞生长速度及迁移能力下降,细胞周期停滞用siRNA干扰Cdc20的表达之后,HepG2细胞的生长速度减慢,处于G2/M期的细胞比例增多,但对细胞迁移能力的影响不大。检测下游的底物分子发现Cdc20表达抑制后p21蛋白表达明显增加。五、结论1.Cdc20在肝细胞癌中普遍存在表达上调。2.Cdc20的高表达与肿瘤分化及TNM分期相关。3.Cdc20与肝细胞癌的不良预后相关。4.抑制Cdc20表达能减慢肿瘤细胞生长速度并诱导细胞G2/M期停滞,同时上调蛋白p21的表达。