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大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在国内外都有较高的发病率。在美欧死亡率高居恶性肿瘤的第2位,我国已从第6位上升为第3位。肿瘤的发生、发展和多种因素相关,其中细胞凋亡基因的突变起着重要作用。凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)在抑制细胞凋亡中有重要作用。Survivin是近年发现的具有独特结构的IAPs家族的成员,在恶性肿瘤中具有较高的表达水平,并且和肿瘤的临床病理分期、淋巴节转移等具有密切的关系,是目前已知的最强的凋亡抑制因子。然而,越来越多的研究发现,Survivin不仅参与凋亡的抑制,还影响肿瘤细胞的增殖、分裂以及转移和侵袭等。但有关Survivin的研究观点仍存在较多的分歧,如:有学者认为Survivin在细胞质中表达与肿瘤的治疗效果和不良预后相关;而也有学者提出相反的观点,在细胞质中分布提示肿瘤预后良好。有学者认为Survivin在G1/S期发挥作用,但也有认为调控G2/M期。因此Survivin作用机制复杂,需要从整体水平深入探讨Survivin调控机制。蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质变化的特征,通过观察干预前后组织细胞水平蛋白质表达变化及差异,了解特定因素对肿瘤细胞的蛋白质表达影响,明确干预因素的作用机理。另外,RNA干扰(RNA interference,RNAi)是可诱导目的基因同源mRNA降解阻断特定基因的表达,具有高度特异性和高效性。本研究应用RNAi技术,沉默Survivin基因的表达,分析结肠癌细胞生物学特性的变化;提取RNAi前后的细胞总蛋白,采用蛋白质组学技术研究Survivin调控下的差异蛋白变化,寻找与Survivin功能相关的蛋白质。第一部分Survivin在结肠癌中的表达及分布目的:探讨Survivin在结肠癌临床标本和细胞株中的表达及分布。方法:采用免疫组织化学和免疫细胞化学的方法研究Survivin在结肠癌细胞中的表达水平及分布,明确Survivin表达与肿瘤临床特点的关系。结果:在结肠癌临床组织标本中,Survivin阳性表达率为57.6%,结肠癌细胞株LoVo、HCT116、SW480中均有Survivin表达。Survivin以细胞质表达为主。Spearman相关分析显示Survivin表达与肿瘤患者的临床Ducks分期存在相关性。结论:在结肠癌临床组织和细胞株中Survivin表达均较高,并以细胞质表达为主。Survivin与肿瘤的Ducks分期具有相关性。第二部分携带针对人Survivin的shRNA的腺病毒的转染及对结肠癌细胞生物学特性的影响目的:研究Survivin基因对结肠癌细胞增殖、凋亡、周期和侵袭的影响。方法:扩增、纯化携带针对人Survivin的shRNA的增殖缺陷型腺病毒,利用流式细胞技术、RT-PCR、Western-bolt等检测对结肠癌细胞的感染及基因抑制效果。针对Survivin基因沉默后的结肠癌细胞,采用流式细胞仪、MTT、单克隆平板、细胞侵袭实验等,检测Survivin基因在体外对细胞增殖、凋亡、细胞周期和侵袭的影响。另外研究Survivin基因体内对肿瘤生长的抑制作用。结果:增殖缺陷型腺病毒在MOI为50时,转染率为92.67%,并具有明显基因沉默作用。Survivin基因沉默后,凋亡率明显增加,G1/S期细胞增多,G2/M期细胞减少,细胞侵袭能力减弱,Survivin在体内外均可抑制结肠癌细胞的生长。结论:构建的增殖缺陷型腺病毒具有较高的转染率和基因沉默高效性,Survivin对结肠癌细胞的凋亡、增殖、周期及侵袭有明显的影响。第三部分蛋白质样品制备、双向电泳及图谱分析目的:探讨RNAi后的蛋白质样品制备、双向电泳的条件及方法,为Survivin调控下差异蛋白的分析奠定基础。方法:免疫荧光分析Survivin在SW480中的分布;采用液氮冻融,RNase、DNase酶解及超声裂解等方法获取蛋白质样品,在不同蛋白浓度和聚焦强度下进行双向电泳,采用硝酸银染色并对图像进行分析。结果:在结肠癌细胞SW480中,Survivin主要分布在细胞质中。液氮冻融,RNase、DNase酶解及超声裂解等处理可明显降低核酸的影响,促进蛋白的溶解。250ug上样量及70000Vh聚焦后,图像分辨率和重复性均较好,在pI=4-8和Mr(15-120)×103分布的蛋白质点较多,蛋白质点数为1400个左右,超过80个蛋白质点存在明显差异。结论:成功建立了分辨率及重复性均较好的双向电泳图谱。第四部分差异蛋白质的质谱鉴定及Survivin调控机制分析目的;对Survivin基因沉默前后的差异蛋白进行质谱分析,探讨Survivin在结肠癌中的作用机制。方法:采用质谱分析及数据库信息检索,明确与Survivin相互作用蛋白质的变化;Western-bolt对兴趣蛋白质进行表达验证;免疫沉淀检测与Survivin直接作用的蛋白质。结果:经质谱分析有36种差异蛋白质被发现,差异蛋白质存在于多种细胞器,参与多种通路的调控,具有凋亡、周期、细胞代谢及侵袭等不同功能。对Caspase-10及CDK9进行表达验证。CDC2及HSPD1可能与Survivin存在相互作用。结论:细胞质中Survivin参与多种通路的调控。