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目的:脉络膜黑色素瘤(choroid melanoma,CM)是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤,其发生发展存在多种机制。其中P16-cyclinD-CDK4/6-RB通路是与细胞周期相关的通路,众多研究表明其激活会促进脉络膜黑色素瘤细胞的增殖。近些年,随着microRNA的研究逐渐增多,已有多种microRNAs被证实参与了脉络膜黑色素瘤的发生发展。根据microRNA的经典作用机制,通过生物信息学网站预测,发现miR-15b-5p与CDK4的3’UTR区域存在序列互补。因此,本研究将探讨miR-15b-5p通过靶向抑制细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)的表达进而发挥负向调节脉络膜黑色素瘤细胞增殖的作用。方法:1、采用CCK8检测CDK4特异性抑制剂Fascaplysiny对人眼侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞系(MUM-2B,MUM-2C)细胞增殖的作用。2、采用双荧光素酶报告分析检测miR-15b-5p与CDK4 mRNA的3’UTR区域结合情况。3、使用脂质体分别转染negative control RNA、miR-15b-5p mimics、inhibitor N.C RNA和miR-15b-5p inhibitor进入MUM-2B细胞中,采用实时定量PCR检测以上4组细胞miR-15b-5p的表达水平以验证转染效率。4、采用Western Blot检测4组细胞中CDK4的蛋白表达量。5、采用CCK8检测4组细胞的增殖能力。6、采用流式细胞术检测4组细胞的细胞周期情况。结果:1、CCK8检测结果显示:与对照组(0nM)相比加药组(100nM)细胞增殖能力显著下降。在MUM-2B细胞中,72h时加药组的相对OD值是对照组的58.1%(t=10.57,P<0.001);在MUM-2C细胞中,72h时加药组的相对OD值是对照组的49.8%(t=10.09,P<0.001)。2、双荧光素酶报告分析结果显示:与对照组(WT+nc组)相比共转染CDK4 3’UTR野生型质粒与miR-15b-5p mimics组(WT+mi组)的荧光素酶活性显著降低(t=7.81,P<0.01);共转染CDK4 3’UTR突变型质粒的两组(MT+nc组和MT+mi组)间荧光素酶活性没有显著差别。3、实时定量PCR结果显示:与nc组相比mimics组中miR-15b-5p表达显著增加(t=25.01,P<0.0001);与inhibitor nc组相比,inhibitor组miR-15b-5p表达显著减少(t=25.01,P<0.0001)。4、Western Blot检测结果显示:过表达miR-15b-5p后,CDK4的蛋白表达水平降低(t=4.92,P<0.01);抑制miR-15b-5p表达后,CDK4的蛋白表达水平升高(t=3.33,P<0.05)。5、CCK8检测结果显示:过表达miR-15b-5p后,细胞增殖能力减弱,72h时mimics组的相对OD值是nc组的67.22%(t=9.32,P<0.001);抑制miR-15b-5p表达后,细胞增殖能力增强,72h时inhibitor组的相对OD值是inhibitor nc组的1.37倍(t=5.72,P<0.01)。6、流式细胞术检测结果显示:过表达miR-15b-5p后,细胞G1期比例增多,nc组与mimics组G1期细胞百分比为[(75.98±0.50)%和(81.79±0.75)%],差异有统计学意义(P<0.01);抑制miR-15b-5p表达后,细胞G1期比例减少,inhibitor nc组与inhibitor组G1期细胞百分比为[(76.36±0.98)%和(70.82±1.01)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、CDK4在脉络膜黑色素瘤细胞系的恶性增殖中起促进作用。2、miR-15b-5p能够靶向结合CDK4,并抑制CDK4表达。3、miR-15b-5p能够诱导脉络膜黑色素瘤细胞形成G1/S期阻滞,并抑制其恶性增殖。