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研究背景:G蛋白偶联受体(G Protein Coupled Receptors, GPCRs)是位于细胞膜上的一类膜蛋白质分子的统称,这类蛋白质分子数量庞大,在人类基因组中由800多个成员组成,并且与很多疾病相关,现代临床处方药有40%是以GPCRs作为药物靶点。GPCRs有相同的结构特征和功能,在结构上它们都由1个在细胞外的N端和在细胞内的C端,7个跨膜的α螺旋、连接跨膜α螺旋的3个胞外环和胞内环组成,形成极其相似的7次跨膜结构；在功能上它们都能起到介导细胞信号转导的作用,即响应细胞外信号分子的刺激,并将其转换为细胞内的信号并引起下游一系列生物化学反应的过程。在介导细胞外信号转化为细胞内信号的时候需要与细胞内的G蛋白或arrestin蛋白发生相互作用,使G蛋白或arrestin被激活从而产生相应第二信使并激活下游信号通路。能够与GPCRs相互作用的G蛋白是以α、β、γ三个亚基组成的异源三聚体形式存在,迄今发现20种α亚基、5种β、10种γ亚基,不同的α亚基能够产生不同的第二信使从而导致不同的下游信号通路的产生。不同的GPCRs能够与不同的G蛋白相互作用并产生差异性的信号通路进而调节多样化的生理功能。GPR64是一种G蛋白偶联受体,有很长的胞外端和一个自水解位点。GPR64主要表达在人类和小鼠附睾以及人类前列腺癌,另外在甲状旁腺和中枢神经系统也有表达,研究发现其在雄性生殖系统中重吸收睾丸液和调节精子浓度的过程中发挥重要功能,然而GPR64的信号转导通路及其与G蛋白作用的分子机制并未研究清楚。研究目的：通过检测第二信使的方法发现GPR64的信号转导通路。通过分子突变及功能实验找到GPR64与G蛋白相互作用的关键氨基酸来阐述GPR64偶联G蛋白时的分子机制。研究方法：通过GloSensor cAMP assay检测过表达GPR64是否能使第二信使cAMP发生变化,通过钙离子下游NFAT转录调控的双荧光素酶表达系统检测GPR64是否能使钙离子发生变化,通过quickchange构建GPR64突变体并用GloSensor assay和NFAT转录调控双荧光素酶表达系统检测突变体与G蛋白是否能够发生相互作用。研究结果：GloSensor cAMP assay检测到GPR64能够使第二信使cAMP升高。NFAT转录调控双荧光素酶表达系统检测到GPR64能够使NFAT转录水平升高。GPR64FL比GPR64p激活第二信使cAMP和引起NFAT转录调控的能力均有下降。不同的GPR64突变体对cAMP和NFAT转录调控有不同的影响。结论: GPR64能够介导Gs与Gq信号通路,从而使第二信使cAMP和钙离子水平升高。在激活Gs信号通路时,GPR64通过第696位和第697位的组氨酸和甲硫氨酸、第704位缬氨酸、第705位苯丙氨酸与Gαs蛋白相互作用；通过第696位和第697位的组氨酸和甲硫氨酸、第708位的酪氨酸、第803位和第804位的精氨酸和赖氨酸与Gαq蛋白相互作用。