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一、背景与目的目前,缺血性心脏病仍是严重危害公共健康的主要疾病之一,其发病率逐年上升,患者越来越年轻化。缺血性心脏病的常见病因除了冠心病之外,长期大量摄入酒精（又称乙醇）引起心肌缺血、左室收缩功能不全、心室重构所导致的酒精性心肌病（alcoholic cardiomyopathy,ACM）也是引起缺血性心脏病的常见原因之一。中国饮酒人数众多,尤其在北方地区,因此罹患酒精性心肌病的患者众多。产期、孕期或哺乳期饮酒过多,可引起流产、早产、胎儿畸形等,对胎儿的心脏、大脑等发育产生不良影响。长期心肌缺血会使心肌发生重构,早期心肌尚可代偿,随着时间的延长,心肌出现失代偿,患者出现心力衰竭的症状和体征,最终导致心力衰竭。心力衰竭是21世纪心血管医生面临的两大挑战之一,心力衰竭的治疗包括药物、手术等方法,终末期心力衰竭的最终治疗手段主要是心脏移植,但由于心脏供体资源严重缺乏,且需要严格配型,手术创伤大,费用高,很多患者在等待供体的过程中死亡。近年来,研究发现,干细胞移植有望修复受损心肌,为改变心脏供体缺乏这一现状带来新的希望。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）具有无限增殖、可分化为内胚层、中胚层、外胚层各种细胞系的能力,是研究细胞增殖、发育的良好试验对象。文献报道乙醇对ESCs有毒性作用,其主要病理机制是活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）聚集导致心肌细胞凋亡,乙醇可显著增加凋亡因子的表达,降低活化细胞的数量,抑制ESCs的分化。但乙醇对ESCs增殖和向心肌细胞分化的影响及其机制目前尚不清楚。胚胎干细胞的分化方向受多种转录因子和细胞内外信号通路的调节,Wnt/β-catenin信号通路就是其中之一。有β-catenin参与的Wnt信号称为经典Wnt/β-catenin信号通路,其作用原理是:当Wnt信号通路被激活时,可使细胞内β-catenin水平升高,蓄积在细胞质内的β-catenin开始向细胞核内转移,与细胞核内LEF/TCF家族的转录因子结合并激活靶基因的转录因子,从而促进细胞增殖、分化、迁移等过程。当Wnt信号通路被抑制时,细胞内β-catenin与其他分子结合形成复合物被泛素化而降解,使细胞内β-catenin浓度降低,不能进入细胞核内与转录因子结合,从而不能参与细胞活动。乙醇可抑制ESCs增殖和分化,而Wnt/β-catenin信号通路可促进ESCs增殖和分化,那么乙醇和Wnt/β-catenin信号通路二者是何关系呢?乙醇是否是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现对ESCs增殖和分化的抑制作用呢?这正是本课题要探讨的问题。二、研究方法（一）小鼠胚胎干细胞的培养采用小鼠胚胎干细胞D3作为研究对象,加入0.1 mM 2-巯基乙醇,1000 U/mL小鼠白细胞介素抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）和12.5%ES-qualified胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）,在37°C、5%CO2的细胞培养箱中培养。（二）乙醇对干细胞的毒力测定采用MTT[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]（商品名:噻唑蓝）试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测不同浓度乙醇作用于分化和未分化ESCs不同时间,对ESCs产生的毒力。（三）不同浓度乙醇作用不同时间对ESCs增殖、分化及Wnt/β-catenin信号通路标记物mRNA水平表达的影响ESCs在不同浓度乙醇中培养0d,3d,7d,11d,14d,采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测ESCs多能基因Sox-2、Oct-4、Nanog的表达,在第11d分化后检测心脏标志基因如Nkx2.5、Mef2c、Tbx5、dHand、αMHC、Cx43和肌钙蛋白C1（Troponin C1）的表达,以及Wnt/β-catenin信号通路标记物β-catenin及其靶蛋白cyclinD1的表达。（四）乙醇对ESCs分化及Wnt/β-catenin信号通路标记物蛋白水平表达的影响采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹法（Western blotting,WB）分析心脏分化相关因子CX43、Troponin C1,及Wnt/β-catenin信号通路标记物β-catenin及其靶蛋白CyclinD1的表达,以及在Wnt信号激动剂Wnt3a和抑制剂DKK1存在的情况下,两者表达的差异。（五）光镜下观察乙醇对心肌细胞跳动特征的影响记录光镜下心肌细胞跳动百分比和跳动面积,以评估乙醇对ESCs向心肌细胞分化能力的影响。（六）统计学分析采用SPSS21.0软件进行单或双因素方差分析,并进行Tukey’s事后检验。数据p<0.05有统计学意义。三、结果（一）乙醇抑制分化及未分化ESCs增殖MTT和LAD检测结果显示:68.5mM和85.6 mM乙醇显著抑制未分化ESCs的生长(F（5,59）=63.25,p值分别为p=0.0053,p=0.0034),使较多LDH释放至培养基中(F（5,59）=32.71,p值分别为p=0.0041,p=0.0026);同时,51.4mM,68.5mM和85.6 mM乙醇抑制分化ESCs生长(F（5,59）=120.36,p分别为p=0.0389,p=0.0031,p=0.0019),更多的LDH释放至培养基中(F（5,59）=64.81,p值分别为p=0.0074,p=0.0047,p=0.0028)。凋亡试验显示:高浓度乙醇对分化ESCs和未分化ESCs均可引起凋亡增加。细胞计数试剂盒检测结果显示:68.5mM和85.6mM乙醇对未分化ESCs有明显的细胞毒性,而51.4mM、68.5mM和85.6mM乙醇对分化ESCs有明显的细胞毒性。可见,乙醇对分化及未分化ESCs的增殖均有抑制作用,且乙醇浓度越高,对ESCs的抑制作用越强。（二）乙醇抑制ESCs向心肌细胞分化采用qRT-PCR检测17.1mM,34.2mM和51.4 mM乙醇分别作用于ESCs 0d,3d,7d,11d和14d对ESCs多能基因表达的影响,结果发现:17.1 mM乙醇不影响多能基因的表达。但是,34.2mM和51.4 mM乙醇组ESCs多能基因Nanog,Sox2,Oct4的表达高于无乙醇组,提示ESCs多能性消失延迟。同时,对于分化ESCs,34.2mM和51.4 mM乙醇明显抑制Mef2c,Tbx5和αMHC的表达(34.2 mM乙醇组分别为:F（3,279）=88.19,p=0.0349;F（3,279）=44.17,p=0.0069;F（3,279）=60.23,p=0.0053;51.4 mM乙醇组分别为:F（3,279）=88.19,p=0.0076;F（3,279）=44.17,p=0.0058;F（3,279）=60.23,p=0.0042)。Nkx2.5和dHand基因表达也受到51.4 mM乙醇抑制(分别为F（3,279）=8.35,p=0.0088;F（3,279）=18.80,p=0.0064)。采用蛋白印迹法检测发现:与对照组相比,34.2mM和51.4 mM乙醇显著抑制CX43和肌钙蛋白C1的表达(CX43:分别为F（3,59）=26.63,p=0.0069,p=0.0047;肌钙蛋白C1:分别为F（3,59）=59.95,p=0.0062,p=0.0039)。电子显微镜下发现,对于分化ESCs,34.2mM和51.4 mM乙醇组ESCs跳动百分比(F（3,35）=107.95,分别为p=0.0088,p=0.0063)和跳动面积(F（3,31）=139.27,分别为p=0.0049,p=0.0022)均显著下降。可见,乙醇能抑制多能基因如Nanog,Sox2,Oct4表达的缺失,抑制心脏标志如Nkx2.5,Mef2c,Tbx5,dHand,αMHC,Cx43及肌钙蛋白C1的表达,并显著降低心肌细胞跳动百分比和跳动面积。综上,乙醇能抑制ESCs向心肌细胞的分化,维持ESCs保持干细胞的多能状态。（三）Wnt通路激动剂/拮抗剂能改善/加重乙醇对ESCs向心肌细胞分化的抑制作用与对照组相比,51.4 mM乙醇组CX43和肌钙蛋白C1基因的表达显著减少至约50%(F（3,319）=66.36,p=0.0037)和45%(F（3,319）=220.71,p=0.0031)。同时,在wnt3a存在情况下,CX43和肌钙蛋白基因的表达增加至159%(F（3,319）=66.36,p=0.0026)和173%(F（3,319）=220.71,p=0.0019)。乙醇引起的CX43和肌钙蛋白C1基因表达抑制作用可显著被wnt3a缓解(分别为F（3,319）=66.36,p=0.0078;F（3,319）=220.71,p=0.0073)。蛋白印迹法显示,51.4 mM乙醇可显著降低β-catenin(F（3,59）=50.28,p=0.0022)和细胞色素D1(F（3,59）=73.56,p=0.0020)的表达,两者均可通过与wnt3a共处理而得到显著恢复(分别为F（3,59）=50.28,p=0.0052;F（3,59）=73.56,p=0.0051)。在Wnt信号通路抑制剂DKK1存在时,乙醇不能进一步抑制CX43和肌钙蛋白C1的表达,也不能进一步抑制β-catenin和细胞色素D1的表达。可见,乙醇下调CX43和肌钙蛋白C1的表达,抑制ESCs向心肌细胞分化,而Wnt通路激动剂wnt3a/拮抗剂DKK1能显著缓解/加重乙醇诱导的ESCs向心肌细胞分化的抑制作用,提示Wnt信号通路参与乙醇对ESCs的抑制作用,乙醇可能是通过抑制Wnt信号通路实现对ESCs增殖、分化的抑制作用的。四、结论（一）不管ESCs处于分化或未分化状态,乙醇均对ESCs的增殖和分化有明显的抑制作用;（二）乙醇可使ESCs维持多能性特征,抑制其向心肌细胞分化;（三）乙醇可下调Wnt通路相关因子的表达,从而抑制Wnt信号通路;（四）Wnt通路激动剂wnt3a/拮抗剂DKK1能改善/加重乙醇对ESCs向心肌细胞分化的抑制作用,提示乙醇抑制小鼠ESCs增殖和分化很可能是通过抑制Wnt信号通路实现的。