消化道外来感觉神经分为迷走传入和脊髓传入两部分，其胞体分别位于颅底结状神经节(nodose ganglia，NG)和脊髓背根神经节(dorsal root ganglia，DRG)。两者不仅起源不同，其功能上也有显著差异。迷走传入神经对胃和小肠的低强度机械刺激敏感，是低阈值机械感受器；脊髓传入神经含有高阈值和广泛动力机械感受器。肠道高敏感性疾病如肠易激综合症，是常见的慢性胃肠功能紊乱性疾病，表现为腹痛、腹胀、排便习惯改变及大便性状异常等症状，这些症状可能与迷走和脊髓传入神经敏感性的改变有关。因此，小肠迷走和脊髓初级传入神经兴奋性的调节机制及其在内脏高敏感性疾病过程中所起的作用正受到越来越多的重视。　　 在哺乳动物中，介导Ih电流的超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道(Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)家族有4个亚型即HCN1～HCN4，可组成同聚体或异聚体通道。不同亚型构成的HCN通道在通道动力学和药理学特征方面存在差异。在表达有HCN通道的细胞，膜电位的超级化可激活该通道，诱发一内向电流，使膜电位朝去极化方向改变。本研究目的是确定HCN通道对正常和内脏高敏感小鼠空肠初级传入神经机械敏感性的调控作用。　　 1.HCN通道对小鼠肠道传入神经机械敏感性的调节作用：我们在正常小鼠离体空肠标本记录传入神经活动，观察HCN通道拮抗剂对肠道传入神经机械敏感性的影响。在渐增性压力充胀空肠期间，传入神经活动随肠内压的逐步升高呈双相增加，这是由于低阈值、广泛动力机械感受器和高阈值传入神经纤维的依次激活引起的。HCN通道阻断剂CsCl(5 mmol/L)和ZD.7288(10μmol/L)都抑制低阈值肠道传入神经活动，而对高阈值传入神经活动没有明显影响。这些结果提示，低阈值的迷走传入神经可能表达功能性HCN通道，对其兴奋性具有增强作用；而在正常情况下，高阈值的脊髓传入神经的兴奋性并不受HCN通道的调节。　　 2.HCN通道在肠道迷走和脊髓传入神经元的表达与功能：为明确HCN通道对肠道迷走和脊髓传入神经兴奋性的调节作用，我们采用膜片钳和免疫组织化学方法，在迷走和脊髓传入神经元记录lh电流和检测HCN1-4亚型的免疫活性。　　 1)对急性分离培养的小鼠NG和DRG(T7-L2)神经元进行了全细胞膜片钳记录，在电压钳模式下检测超级化电压诱导的lh电流，在电流钳模式下检测超级化电流诱导的膜电位改变。在NG，小(<25μm)、中(25-35μm)和大(>35μm)细胞分别有36％(10/28)、56％(30/54)和100％(1/1)表达Ih电流；在DRG，也分别有23％(9/39)、70％(61/87)和100％(14/14)的小、中和大细胞表达lh电流。大神经元上lh的幅度大于中小神经元，-120 mV时电流峰值分别为DRG：-60.51±13.60 pA，-139.00±14.81 pA，-318.77±62.59 pA；NG：-78.18±18.88 pA，-81.96±14.80 pA，-170.69 pA，但各直径组lh的激活曲线无明显差别。lh可被CsCl(5 mmol/L)完全阻断。在电流钳模式下，超级化电流刺激时，膜电位发生瞬时超级化后随即去极化，呈现出“袋状”(sag)的膜电位变化，这种继发性去极化也可被CsCl完全阻断。这些结果证实，部分迷走和脊髓初级传入神经元表达有功能性HCN通道，HCN通道激活可使这些神经元的兴奋性提高。　　 2)为明确HCN通道在肠道的脊髓和迷走初级传入神经元上的表达与功能，我们向小鼠空肠壁微量注射荧光指示剂Dil逆行以标记支配肠道的DRG和NG神经元，并对Dil阳性细胞进行全细胞膜片钳记录。在71.4％(20/28)的Dil阳性DRG神经元和90.9％(10/11)的Dil阳性NG神经元上都记录到超级化激活的、可被胞外CsCl阻断的内向电流(lh)。由于HCN1-4对cAMP的敏感性不同，我们观察了8-Br-cAMP(可透膜进入细胞内)对Dil阳性NG和DRG细胞lh电流的影响，发现8-Br-cAMP可促进部分(3/11)DRG神经元lh电流的激活，而对NG神经元的lh电流没有明显影响。这些结果不仅证实小肠传入神经元大都表达功能性HCN通道，而且提示小肠的迷走和脊髓传入神经元可能表达不同的HCN亚型。　　 3)采用免疫荧光法检测了DRG和NG中HCN1-4免疫活性。在未做肠道逆行标记的神经节标本，DRG和NG切片中都未检测到HCN1免疫活性；在DRG内，12.3％神经元和大量神经纤维高表达HCN2，但在NG内仅有2.3％神经元和少量神经纤维表达HCN2；DRG内部分神经元弱表达HCN3，但NG内多数神经元有相对较强的HCN3免疫染色；DRG内偶见HCN4阳性的神经元，但NG内未检测到HCN4免疫活性。在取自肠壁注射了Dil的小鼠的神经节，可见部分Dil阳性DRG神经元高表达HCN2和弱表达HCN3，而Dil阳性NG神经元具有相对较强的HCN3染色。这些结果表明，在正常动物，支配小肠的迷走初级传入神经元主要表达HCN3，而脊髓初级传入神经元主要表达HCN2。　　 3.HCN通道在外周性内脏高敏感中的作用：采用空肠腔内注射TNBS(TNBS：50mg/kg，30％乙醇1.5 ml/kg)的方法建立肠道高敏感模型，在建模后7、14、21和56天，离体肠管实验测定空肠传入神经对充胀刺激的反应，观察HCN阻断剂对传入神经机械敏感性的影响，并采用免疫组化方法检测DRG和NG内HCN1-4免疫活性，从而分析HCN通道在外周性内脏高敏感中的作用。初步结果显示：　　 1)与对照组相比，TNBS处理后7-56d，空肠传入神经的低阈值放电活动没有明显改变，但高阈值放电活动明显增加。在TNBS处理后7d组，CsCl(5mmol/L)对低阈值和高阈值放电活动皆没有明显影响；TNBS处理后14d组，CsCl抑制低阈值放电活动，但增强高阈值放电活动；TNBS处理后21d组，CsCl抑制低阈值放电，对高阈值放电无明显影响；TNBS处理后56d组，CsCl对低阈值和高阈值放电皆无明显影响。　　 2)与对照组相比，TNBS处理后7-56d，NG和DRG内HCN2免疫活性呈逐步增加的趋势，其中14d组NG内及21d组DRG内的HCN2阳性细胞计数显著增加(14d-NG：8.76％vs2.33％，P<0.05；21d-DRG：30％vs12.3％，P<0.05)，但NG和DRG内HCN3的表达水平没有明显改变。　　 综上所述，本研究在细胞及器官水平探讨了HCN通道在小肠传入神经上的表达及对传入神经机械敏感性的调节作用。研究结果较清楚地表明：支配小肠的迷走初级传入神经元主要表达HCN3亚型，对其兴奋性有增强作用，HCN阻断剂可以抑制小肠迷走传入神经的机械敏感性；支配小肠的脊髓初级传入神经元主要表达HCN2，但在正常情况下，HCN2对脊髓传入神经的兴奋性并不起重要的调节作用。本研究还试图揭示HCN通道与外周性内脏高敏感的联系。初步结果提示，脊髓和迷走传入神经上HCN2表达增加可能在内脏高敏感的发生和发展中起一定作用，但对于这一点，本研究尚未能提供结论性的证据。