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肠道菌群在动脉粥样硬化(As)的发生发展中起重要作用。胆碱类化合物的肠道菌群代谢产物氧化三甲胺(TMAO)促As病变，但其致As机制尚不清楚。血管内皮细胞损伤为As病变的重要环节，并与As性心血管疾病的临床事件密切相关。近来的研究表明，细胞焦亡(炎性、程序性的细胞死亡)参与As的发生、发展。本研究拟以琥珀酸脱氢酶B(SDHB)为切入点，从活性氧(ROS)以及线粒体自噬的角度探讨TMAO对血管内皮细胞焦亡的影响及其调控机制，为As的有效防治提供新的策略和靶点。
实验分为三个部分。第一部分：采用ApoE-/-小鼠以及人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)探讨TMAO对As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响，并从SDHB/ROS途径探讨TMAO致HUVECs焦亡的分子机制；第二部分：从SDHB/线粒体自噬角度探讨TMAO致HUVECs焦亡机制；第三部分：基于SDHB在TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡中的核心作用，筛选靶向调控SDHB的miR。
第一部分TMAO对ApoE-/-小鼠As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响
目的：观察TMAO对ApoE-/-小鼠As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响，探讨SDHB/ROS途径在TMAO促As中的作用。
方法：将20只ApoE-/-小鼠随机分为对照组和TMAO组，每组10只，高脂饮食喂养12周。分离主动脉，苏木精和曙红(H＆E)、油红O和Masson染色观察As病变。免疫荧光染色检测ApoE-/-小鼠As斑块血管内皮细胞中的caspase-1，NLRP3和SDHB表达；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ApoE-/-小鼠血清IL-1β水平。SDHB过表达慢病毒或SDHBshRNA慢病毒转染HUVECs，建立SDHB过表达以及SDHBshRNA人脐静脉血管内皮细胞。Westernblot检测Caspase-1、NLRP3、IL-1β、SDHB的蛋白表达。MitoTrackerGreen探针和透射电子显微镜检测线粒体数量以及形态的改变，流式细胞仪结合JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP，Δψ)的变化，ATP试剂盒检测ATP含量，红色荧光探针(DHE)检测细胞内ROS水平。ROS清除剂NAC预处理观察ROS对TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡的影响。
结果：TMAO促高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变，H＆E染色显示TMAO组As病变比对照组更明显(P＜0.05)，油红O和Masson染色显示TMAO组As病变的胶原含量和脂质沉积增加(P＜0.05)。TMAO组ApoE-/-小鼠中As病变处血管内皮细胞中SDHB以及NLRP3、Caspase-1表达上调，血清IL-1β水平显著升高(P＜0.05)。TMAO显著上调HUVECs中Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18、GSDMD以及SDHB的表达(P＜0.05)。TMAO处理组的线粒体数量减少(P＜0.05)，线粒体形态发生明显变化，表现为线粒体嵴缩短并形成空泡样结构。TMAO显著降低了Q2/Q3区的比例(34.13％)(P＜0.05)。与对照组相比，TMAO组ATP生成减少，ROS水平升高(P＜0.05)。SDHBshRNA抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase-1，IL-1β和IL-18上调(P＜0.05)。SDHB过表达促HUVECs中ROS的产生，而SDHBshRNA抑制HUVECs中ROS的产生以及TMAO诱导的ROS生成。ROS清除剂NAC明显降低细胞内ROS含量并抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase1，IL-1β和IL-18表达(P＜0.05)，这表明TMAO通过SDHB/ROS途径诱导血管内皮细胞焦亡。
结论：
①TMAO促高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变发生、发展；
②TMAO通过SDHB/ROS途径促血管内皮细胞焦亡。
第二部分SDHB/线粒体自噬介导TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡
目的：观察SDHB对血管内皮细胞线粒体自噬的影响以及干预线粒体自噬对TMAO诱导血管内皮细胞焦亡的影响，探讨SDHB/线粒体自噬在TMAO诱导血管内皮细胞焦亡中的作用。
方法：免疫荧光检测高脂饮食ApoE-/-小鼠As斑块血管内皮细胞自噬相关基因LC3II以及Beclin1的表达。TMAO处理HUVECs，Westernblot检测SDHB以及线粒体自噬相关基因LC3II，LC3I,Beclin1,PINK1，Parkin和p62的表达，透射电镜观察线粒体自噬的改变。采用自噬抑制剂3-MA以及BaflomycinA1观察自噬干预对TMAO诱导的HUVECs焦亡的影响。建立SDHB过表达以及SDHB低表达的HUVECs，观察SDHB干预对HUVECs线粒体自噬以及TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡的影响。
结果：TMAO上调高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变处血管内皮细胞线粒体自噬相关蛋白LC3II和beclin1表达。600μMTMAO处理HUVECs24h，线粒体自噬相关分子LC3II、Beclin1、PINK1以及Parkin蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)，线粒体形态异常，且线粒体自噬明显增强。自噬抑制剂3-MA下调TMAO诱导的Beclin1、LC3II、PINK1以及Parkin的表达(P＜0.05)。自噬抑制剂BaflomycinA1下调TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3、GSDMD、Caspase1、IL-1β、IL-18的表达(P＜0.05)。
TMAO上调HUVECsSDHB的表达。SDHB过表达的HUVECs线粒体自噬相关基因LC3II、Beclin1、PINK1以及Parkin表达增强，线粒体形态异常，线粒体自噬小体增多。SDHBshRNA下调HUVECLC3II、Beclin1的表达(P＜0.05)，并抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase-1，IL-1β和IL-18的表达。
结论：
①TMAO增强血管内皮细胞线粒体自噬；
②TMAO通过上调SDHB的表达，诱导血管内皮细胞线粒体自噬。
③抑制线粒体自噬减少TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡。
第三部分miR-2053靶向抑制SDHB表达
目的：基于SDHB在TMAO诱导血管内皮细胞焦亡中的核心作用，筛选靶向调控SDHB表达的miRNAs，为干预和调控TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡及As提供实验依据和参考。
方法：MiRBD和Targetscan7.2预测以SDHB为靶基因的miRNAs。结合自由能分析其与SDHB3’-UTR的结合稳定性，双荧光素酶报告基因以及westernblot验证。
结果：miRDB分析SDHB为靶基因的miRNAs，其中miR-2053与SDHB的3’-UTR144-151靶向结合，分值为94分，是预测的7个靶向调控SDHBmiRNAs分值最高。Targetscan7.2预测以SDHB为靶基因的miRNAs，miR-2053与SDHB的3’-UTR144-151靶向结合，其结合的分值为99分，其结合context++score值为-0.58，推测SDHB的3’-UTR与miR-2053之间有较好的结合。将SDHB的3’-UTR序列和miR-2053序列输入到BiBiserv2.0进行两两结合的能量值计算，得到两者的结合能量值为-13.8kcal/mol，低于能量结合的阈值，说明SDHB的3’-UTR和miR-2053较为稳定结合。双荧光素酶报告基因的结果表明pGL4+SDHBmRNA3’-UTR+miR-2053mimic处理组的荧光强度显著低于pGL4+SDHBmRNA3’-UTR组，pGL4+SDHBmRNA3’-UTR+miR-2053mimic+miR-2053inhibitor处理组荧光强度显著高于pGL4+LPAmRNA3’-UTR+miR-2053mimic处理组(P＜0.05)。westernblot的结果表明miR-2053mimic下调TMAO诱导的SDHB以及IL-1β的表达。
结论：SDHB为miR-2053的靶基因，miR-2053抑制SDHB的表达。
实验分为三个部分。第一部分：采用ApoE-/-小鼠以及人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)探讨TMAO对As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响，并从SDHB/ROS途径探讨TMAO致HUVECs焦亡的分子机制；第二部分：从SDHB/线粒体自噬角度探讨TMAO致HUVECs焦亡机制；第三部分：基于SDHB在TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡中的核心作用，筛选靶向调控SDHB的miR。
第一部分TMAO对ApoE-/-小鼠As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响
目的：观察TMAO对ApoE-/-小鼠As病变、SDHB表达以及血管内皮细胞焦亡的影响，探讨SDHB/ROS途径在TMAO促As中的作用。
方法：将20只ApoE-/-小鼠随机分为对照组和TMAO组，每组10只，高脂饮食喂养12周。分离主动脉，苏木精和曙红(H＆E)、油红O和Masson染色观察As病变。免疫荧光染色检测ApoE-/-小鼠As斑块血管内皮细胞中的caspase-1，NLRP3和SDHB表达；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ApoE-/-小鼠血清IL-1β水平。SDHB过表达慢病毒或SDHBshRNA慢病毒转染HUVECs，建立SDHB过表达以及SDHBshRNA人脐静脉血管内皮细胞。Westernblot检测Caspase-1、NLRP3、IL-1β、SDHB的蛋白表达。MitoTrackerGreen探针和透射电子显微镜检测线粒体数量以及形态的改变，流式细胞仪结合JC-1染色检测线粒体膜电位(MMP，Δψ)的变化，ATP试剂盒检测ATP含量，红色荧光探针(DHE)检测细胞内ROS水平。ROS清除剂NAC预处理观察ROS对TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡的影响。
结果：TMAO促高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变，H＆E染色显示TMAO组As病变比对照组更明显(P＜0.05)，油红O和Masson染色显示TMAO组As病变的胶原含量和脂质沉积增加(P＜0.05)。TMAO组ApoE-/-小鼠中As病变处血管内皮细胞中SDHB以及NLRP3、Caspase-1表达上调，血清IL-1β水平显著升高(P＜0.05)。TMAO显著上调HUVECs中Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18、GSDMD以及SDHB的表达(P＜0.05)。TMAO处理组的线粒体数量减少(P＜0.05)，线粒体形态发生明显变化，表现为线粒体嵴缩短并形成空泡样结构。TMAO显著降低了Q2/Q3区的比例(34.13％)(P＜0.05)。与对照组相比，TMAO组ATP生成减少，ROS水平升高(P＜0.05)。SDHBshRNA抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase-1，IL-1β和IL-18上调(P＜0.05)。SDHB过表达促HUVECs中ROS的产生，而SDHBshRNA抑制HUVECs中ROS的产生以及TMAO诱导的ROS生成。ROS清除剂NAC明显降低细胞内ROS含量并抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase1，IL-1β和IL-18表达(P＜0.05)，这表明TMAO通过SDHB/ROS途径诱导血管内皮细胞焦亡。
结论：
①TMAO促高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变发生、发展；
②TMAO通过SDHB/ROS途径促血管内皮细胞焦亡。
第二部分SDHB/线粒体自噬介导TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡
目的：观察SDHB对血管内皮细胞线粒体自噬的影响以及干预线粒体自噬对TMAO诱导血管内皮细胞焦亡的影响，探讨SDHB/线粒体自噬在TMAO诱导血管内皮细胞焦亡中的作用。
方法：免疫荧光检测高脂饮食ApoE-/-小鼠As斑块血管内皮细胞自噬相关基因LC3II以及Beclin1的表达。TMAO处理HUVECs，Westernblot检测SDHB以及线粒体自噬相关基因LC3II，LC3I,Beclin1,PINK1，Parkin和p62的表达，透射电镜观察线粒体自噬的改变。采用自噬抑制剂3-MA以及BaflomycinA1观察自噬干预对TMAO诱导的HUVECs焦亡的影响。建立SDHB过表达以及SDHB低表达的HUVECs，观察SDHB干预对HUVECs线粒体自噬以及TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡的影响。
结果：TMAO上调高脂饮食ApoE-/-小鼠As病变处血管内皮细胞线粒体自噬相关蛋白LC3II和beclin1表达。600μMTMAO处理HUVECs24h，线粒体自噬相关分子LC3II、Beclin1、PINK1以及Parkin蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)，线粒体形态异常，且线粒体自噬明显增强。自噬抑制剂3-MA下调TMAO诱导的Beclin1、LC3II、PINK1以及Parkin的表达(P＜0.05)。自噬抑制剂BaflomycinA1下调TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3、GSDMD、Caspase1、IL-1β、IL-18的表达(P＜0.05)。
TMAO上调HUVECsSDHB的表达。SDHB过表达的HUVECs线粒体自噬相关基因LC3II、Beclin1、PINK1以及Parkin表达增强，线粒体形态异常，线粒体自噬小体增多。SDHBshRNA下调HUVECLC3II、Beclin1的表达(P＜0.05)，并抑制TMAO诱导的焦亡标记物NLRP3，GSDMD，Caspase-1，IL-1β和IL-18的表达。
结论：
①TMAO增强血管内皮细胞线粒体自噬；
②TMAO通过上调SDHB的表达，诱导血管内皮细胞线粒体自噬。
③抑制线粒体自噬减少TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡。
第三部分miR-2053靶向抑制SDHB表达
目的：基于SDHB在TMAO诱导血管内皮细胞焦亡中的核心作用，筛选靶向调控SDHB表达的miRNAs，为干预和调控TMAO诱导的血管内皮细胞焦亡及As提供实验依据和参考。
方法：MiRBD和Targetscan7.2预测以SDHB为靶基因的miRNAs。结合自由能分析其与SDHB3’-UTR的结合稳定性，双荧光素酶报告基因以及westernblot验证。
结果：miRDB分析SDHB为靶基因的miRNAs，其中miR-2053与SDHB的3’-UTR144-151靶向结合，分值为94分，是预测的7个靶向调控SDHBmiRNAs分值最高。Targetscan7.2预测以SDHB为靶基因的miRNAs，miR-2053与SDHB的3’-UTR144-151靶向结合，其结合的分值为99分，其结合context++score值为-0.58，推测SDHB的3’-UTR与miR-2053之间有较好的结合。将SDHB的3’-UTR序列和miR-2053序列输入到BiBiserv2.0进行两两结合的能量值计算，得到两者的结合能量值为-13.8kcal/mol，低于能量结合的阈值，说明SDHB的3’-UTR和miR-2053较为稳定结合。双荧光素酶报告基因的结果表明pGL4+SDHBmRNA3’-UTR+miR-2053mimic处理组的荧光强度显著低于pGL4+SDHBmRNA3’-UTR组，pGL4+SDHBmRNA3’-UTR+miR-2053mimic+miR-2053inhibitor处理组荧光强度显著高于pGL4+LPAmRNA3’-UTR+miR-2053mimic处理组(P＜0.05)。westernblot的结果表明miR-2053mimic下调TMAO诱导的SDHB以及IL-1β的表达。
结论：SDHB为miR-2053的靶基因，miR-2053抑制SDHB的表达。