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第一部分circWWC3对乳腺癌细胞中IL-4表达的影响目的:探讨circWWC3对乳腺癌细胞IL-4表达的影响。方法:1.在乳腺癌细胞MDA-MB-231中敲低circWWC3后,使用高通量芯片技术筛选出影响细胞通路的关键基因。2.采用qRT-PCR技术检测过表达或敲低circWWC3后乳腺癌细胞中IL-4的表达变化。3.采用Western blot实验检测过表达或敲低circWWC3后乳腺癌细胞中IL-4的表达变化。4.采用ELISA检测过表达或敲低circWWC3后乳腺癌细胞IL-4外分泌量的变化。结果:1.基因芯片分析结果:乳腺癌细胞MDA-MB-231中敲低circWWC3后,IL-4是影响细胞通路的最相关的候选基因之一。2.qRT-PCR结果显示:敲低circWWC3后的乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-4的表达水平显著降低（P<0.01）;过表达circWWC3后的乳腺癌细胞MDA-MB-453中IL-4的表达水平显著升高（P<0.01）。3.Western blot结果显示,敲低circWWC3后乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-4的表达水平显著降低（P<0.01）;过表达circWWC3后的乳腺癌细胞MDA-MB-453中IL-4的表达水平显著升高（P<0.01）。4.ELISA结果显示,敲低circWWC3后的乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-4的外分泌量显著降低（P<0.01）;过表达circWWC3后的乳腺癌细胞MDA-MB-453中IL-4的外分泌量显著升高（P<0.01）。小结:circWWC3能够促进乳腺癌细胞IL-4的表达和分泌。第二部分circWWC3通过调控IL-4的表达影响肿瘤相关巨噬细胞极化进而促进乳腺癌的发展目的:探讨circWWC3通过调控乳腺癌细胞IL-4的表达和分泌对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响。方法:1.使用IL-4诱导巨噬细胞向M2方向极化后,采用qRT-PCR技术检测巨噬细胞表面标志物的表达变化。2.使用IL-4诱导巨噬细胞向M2方向极化后,采用ELISA方法检测巨噬细胞细胞因子和趋化因子的外分泌量的变化。3.将过表达或敲低circWWC3的乳腺癌细胞上清液和巨噬细胞共培养后,采用qRT-PCR技术检测巨噬细胞表面标志物的表达变化。4.将过表达或敲低circWWC3的乳腺癌细胞上清液和巨噬细胞共培养后采用ELISA方法检测巨噬细胞细胞因子和趋化因子的外分泌量的变化。结果:1.qRT-PCR结果显示,采用IL-4诱导巨噬细胞极化后,巨噬细胞表面标志物IL-10、TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的表达水平显著升高（P<0.05）。2.ELISA结果显示,采用IL-4诱导巨噬细胞极化后,IL-10、TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的外分泌量显著增加（P<0.05）。3.qRT-PCR结果显示,将敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面标志物IL-10,TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的表达水平显著降低（P<0.05）;将过表达circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-453上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面标志物IL-10、TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的表达水平显著升高（P<0.01）。4.ELISA结果显示,将敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231上清液和巨噬细胞共培养后,IL-10、TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的外分泌量显著降低（P<0.05）;将过表达circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-453上清液和巨噬细胞共培养后,IL-10、TGF-β、CCL-8、CCL-17、CCL-22的外分泌量显著升高（P<0.01）。小结:IL-4可以诱导巨噬细胞向M2方向极化,circWWC3通过影响乳腺癌细胞IL-4的表达和分泌诱导巨噬细胞向M2方向极化,从而促进乳腺癌的发展。第三部分circWWC3通过调节IL-4影响乳腺癌细胞和巨噬细胞表面PD-L1表达进而促进乳腺癌的发展目的:探讨circWWC3通过调控乳腺癌细胞IL-4的表达和分泌对乳腺癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞表面PD-L1表达的影响。方法:1.使用IL-4诱导巨噬细胞向M2方向极化后,采用qRT-PCR技术检测巨噬细胞表面PD-L1的表达变化。2.使用IL-4诱导巨噬细胞向M2方向极化后,采用免疫荧光技术检测巨噬细胞表面PD-L1的变化。3.在乳腺癌细胞过表达或敲低circWWC3后,采用qRT-PCR技术检测乳腺癌细胞表面PD-L1的表达变化。4.在乳腺癌细胞过表达或敲低circWWC3后,采用免疫荧光技术检测乳腺癌细胞表面PD-L1的变化。5.将过表达或敲低circWWC3的乳腺癌细胞上清液和巨噬细胞共培养后,采用qRT-PCR技术检测巨噬细胞表面PD-L1的表达变化。6.将过表达或敲低circWWC3的乳腺癌细胞上清液和巨噬细胞共培养后,采用免疫荧光技术检测巨噬细胞表面PD-L1的变化。结果:1.qRT-PCR结果显示,采用IL-4诱导巨噬细胞极化后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著升高（P<0.05）。2.免疫荧光结果显示,采用IL-4诱导巨噬细胞极化后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著升高。3.qRT-PCR结果显示,敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231的PD-L1表达水平显著降低（P<0.05）;过表达circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-453的PD-L1表达水平显著升高（P<0.01）。4.免疫荧光结果显示,敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231的PD-L1表达水平显著降低;过表达circWWC3的乳腺癌细MDA-MB-453的PD-L1表达水平显著升高。5.qRT-PCR结果显示,将敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231的上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著降低（P<0.05）;将过表达circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-453的上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著升高（P<0.05）。6.免疫荧光结果显示,将敲低circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-231的上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著降低;将过表达circWWC3的乳腺癌细胞MDA-MB-453的上清液和巨噬细胞共培养后,巨噬细胞表面PD-L1的表达水平显著升高。小结:用IL-4诱导巨噬细胞向M2方向极化,会使巨噬细胞表面PD-L1的表达水平升高,circWWC3通过影响乳腺癌细胞IL-4的表达和分泌也可使巨噬细胞表面PD-L1的表达水平升高,同时circWWC3也能使肿瘤细胞本身PD-L1的表达水平升高,进而促进乳腺癌的进展。结论:我们的研究可以得出以下结论:乳腺癌细胞中,circWWC3可通过促进IL-4的表达和分泌,诱导巨噬细胞向M2型极化,并诱导巨噬细胞和乳腺癌细胞表面PD-L1的表达,从而促进乳腺癌的进展。