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苹果中膜结合态多酚氧化酶约占总PPO的85%,且在某些因素激发下表现出高催化活性,但对其的研究近乎空白。本文比较了红富士、黄元帅、澳洲青苹的膜结合态多酚氧化酶(mPPO)性质,建立了富士苹果mPPO的分离纯化方法,研究了mPPO的酶学特性和生物学信息,探索mPPO三维结构和活性中心结构,并研究不同底物条件下,抑制剂处理对mPPO活性、紫外吸收光谱及荧光发射光谱的影响。主要研究结果如下：(1)红富士、黄元帅、澳洲青苹三者mPPO性质差异显著。红富士mPPO在pH8.00时酶活最高,黄元帅mPPO最适pH为4.50,而澳洲青苹mPPO则在pH7.50～8.00内活性最高。红富士mPPO最适反应温度为55℃,黄元帅mPPO在35-55℃内活性较高且无显著差异,澳洲青苹mPPO在70～75℃内活性最高,且黄元帅mPPO在高温区间热稳定性高于红富士和澳洲青苹mPPO。以邻苯二酚为底物时,澳洲青苹的mPPO对底物亲和力最强,但红富士mPPO催化速率最大。黄元帅与红富士mPPO粗提液有相似酶带,澳洲青苹酶带最少。(2)富士nPPO分离纯化最佳条件为：超声提取10min,50%-80%饱和度硫酸铵沉淀,0.1MNaCl梯度洗脱。纯化后,mPPO纯度提高64.30倍,比活力达387032.97U.mg-1,经SDS-PAGE和Native-PAGE分析均为单一蛋白带,经串联质谱分析及蛋白数据库鉴定为多酚氧化酶。(3)富士中mPPO与可溶态多酚氧化酶(sPPO)性质差异明显。mPPO活性是sPPO活性的34.12倍。mPPO及sPPO最适作用底物分别为4-甲基儿茶酚和邻苯二酚。mPPO及sPPO的最适反应pH值分别为8.00和4.50,最适反应温度分别为65和45℃。mPPO比sPPO更耐酸碱环境的变化,而mPPO比sPPO更耐高温。L-半胱氨酸对mPPO的抑制作用最强,但EDTA在一定浓度时对mPPO具有激活作用。(4)富士苹果mPPO位于叶绿体膜上,为疏水性膜整合蛋白。其大部分肽段位于细胞质中,肽段的1-39氨基酸残基为信号肽,82-97为N-端的一段跨膜肽段,548-567为C端的一段跨膜肽段。其三维结构由6个α-螺旋,2个p-折叠和10个无规卷曲组成。mPPO活性中心是由疏水氨基酸(His191、His221、Phe217、Tyr224、Phe374)组成的疏水口袋。以4-甲基儿茶酚为底物时,6个极性氨基酸残基(His191、His221、Trp224、Trp228、Phe227和Val190)参与了反应,这些氨基酸对于底物的结合非常重要。(5)作用于不同底物时,抑制剂对富士苹果mPPO的抑制效果、类型和机制不同。以4-甲基儿茶酚为底物时,谷胱甘肽对mPPO抑制效果最好,为反竞争性抑制。以邻苯二酚和4-甲基儿茶酚为底物时,L-半胱氨酸、谷胱甘肽和抗坏血酸均使mPPO酶活出现延迟,但延迟趋势不同。mPPO的最大荧光发射波长为303.84nm,表明其Trp残基内埋于蛋白质内部。各种抑制剂的加入使mPPO的荧光发射强度发生不同程度的猝灭,抗坏血酸对nPPO荧光的猝灭效果最显著。△λ=15nm时,mPPO荧光发射峰λmax为280nm, Δ=60nm时有两个荧光发射峰(230nm处为主峰,270nm处为次峰)。EDTA对主峰的猝灭作用最强,抗坏血酸对次峰的猝灭作用最强。