黄瓜花叶病毒卫星RNA小RNAs的分离和鉴定

来源 :中国科学院微生物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:rongweihua
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RNA沉默是存在于多数真核细胞中保守的基因调控机制,也是一种在植物中广泛存在的抵抗外源核酸的免疫反应机制。病毒感染植物之后,来自于具有一定高级结构的正义单链RNA病毒的siRNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)在植物细胞内大量累积。DCL4蛋白是这些病毒小分子RNA的主要加工蛋白。然而,DCL4蛋白识别这类病毒单链RNA结构的机制仍不清楚。这类小分子RNA的功能还没有被广泛研究。   黄瓜花叶病毒(山东株系)粒子中含有一类大小为334nt的线型单链非编码卫星RNA分子,它在植物体或原生质体内必须依赖于辅助病毒(Helper virus)复制、包被并在寄主内扩散的寄生于病毒的亚病毒,它具有高度有序的二级结构,其核苷酸序列与辅助病毒RNA之间没有或很少有同源性。   利用直接克隆的方法分离和鉴定来源于卫星RNA的小分子RNA(satelliteRNA small interfering RNA,satsiRNA)。通过研究卫星RNA的二级结构与小分子RNA的剪切加工之间的关系来探讨satsiRNA的生物合成机制。   结果表明,多数正链的satsiRNAs来自卫星RNA单链形成的高级结构前体,克隆频度较高的正链satsiRNAs分子来自卫星RNA自身折叠形成的“T”型结构。该“T”型结构与已知的microRNA的发夹结构前体和siRNA的双链RNA前体存在较大不同。植物病毒沉默抑制子2b蛋白存在条件下卫星RNA小分子RNA与植物内源小分子RNA成熟链和星号链的累积程度不同,进一步证明了这些satsiRNAs来自卫星RNA的“T”型结构。   结果还表明:DCL4蛋白是识别剪切卫星RNA小分子RNA首要蛋白,在DCL4缺失条件下,DCL2是卫星RNA小分子RNA的生物合成途径巾重要的蛋白。   利用拟南芥m1R159a前体骨架表达卫星RNA小分子RNA satslR-12以研究其功能。GFP基因与靶位点融合(GFP-sensor),通过共注射本生烟中瞬时表达GFP荧光的水平和Northern blot检测GFP mRNA研究小分子RNA对靶位点的作用。初步结果表明卫星RNA小分子RNA satsiR-12对GFP-sensor的表达有调节作用。satsiR-12对GFP-sensor的调控机理正在进行中。
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