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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的免疫抑制性疾病,其主要引起仔猪死亡、肥育猪生长缓慢、母猪中晚期流产和死胎。PRRSV感染具有严格的细胞嗜性和受体依赖性,其在体内主要感染以肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)为代表的单核-巨噬细胞谱系(monocyte-macrophage lineage)。PRRSV感染使体内多种细胞因子表达失调,不同毒力PRRSV毒株的感染导致PAMs在细胞因子的表达上也有一定差异。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF),最初发现该细胞因子在造血细胞的发育分化过程中发挥重要功能。最新研究表明,在受到不同信号刺激和免疫微环境的影响下,GM-CSF在疾病发展和炎症反应中表现为双向调控:一方面能够募集炎性巨噬细胞进入感染或炎症局部组织,进一步加剧炎症反应;另一方面也可以通过招募免疫调节性树突状细胞而对免疫应答负调节。虽然有报道利用猪GM-CSF与PRRSV疫苗株或PRRSV结构蛋白融合表达用于增强疫苗的免疫保护效果,但对于该细胞因子在PRRSV感染过程中的作用尚无报道。因此本课题首先建立一种猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)的双抗体夹心ELISA定量检测方法;进一步通过该方法对不同PRRSV毒株感染PAMs后细胞分泌pGM-CSF蛋白与PRRSV攻毒组和抗体治疗组的动物血清中pGM-CSF蛋白的含量进行分别测定,初步确立该检测方法的应用范围。本研究的工作和结果如下:1. 抗pGM-CSF单克隆抗体与多克隆抗体的制备与活性鉴定构建原核重组表达载体p ET28a-pGM-CSF,表达并纯化了重组pGM-CSF蛋白,重组蛋白免疫BALB/c小鼠与新西兰大白兔。待小鼠血清中抗体效价达到10~5及以上后,进行细胞融合。阳性克隆经过三轮亚克隆后获得稳定分泌抗pGM-CSF的单克隆抗体两株,分别命名为Mab-1B7E10与Mab-2A4H11,经验证具有良好活性。待兔血清效价达到10~6及以上时,采集阳性血清。CNBr活化的琼脂糖4B耦联重组pGM-CSF蛋白用于兔多抗的纯化,亲和层析后获得纯度较高的抗pGM-CSF的多克隆抗体,经验证具有良好活性。2. 抗pGM-CSF双抗体夹心ELISA检测方法的建立以Mab-2A4H11作为捕获抗体(包被浓度为10μg/m L),兔多克隆抗体作为检测抗体(浓度为1.6μg/m L),建立定量检测pGM-CSF的双抗体夹心ELISA检测方法,条件为捕获抗体4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,待检样品、检测抗体与酶标二抗依次分别37℃孵育1 h后显色。以梯度稀释的重组pGM-CSF蛋白作为标准品绘制标准曲线,确定检测方法的灵敏度为42.5pg/m L,通过无关细胞因子的检测,确定检测方法的特异性。3. 建立的双抗体夹心ELISA检测方法的应用应用本课题建立的双抗体夹心ELISA检测方法对不同PRRSV毒株感染PAMs后细胞分泌pGM-CSF蛋白与PRRSV攻毒组和PRRSV攻毒+抗体治疗组的动物血清中pGM-CSF蛋白的含量进行分别测定。不同毒株PRRSV感染PAMs后,在m RNA水平上,与对照组相比,均有显著性升高,随后分别使用上述建立的ELISA检测方法和商品化试剂盒对感染PRRSV的PAMs细胞培养上清中pGM-CSF蛋白进行检测,结果显示两种方法均未检测到分泌的pGM-CSF蛋白,提示PRRSV感染细胞的过程中存在转录后抑制,但原因尚不明确。对采集的临床样品检测结果显示,PRRSV攻毒+抗体治疗组的动物血清样本中能够检测到pGM-CSF蛋白,其含量在1075-5025 pg/m L之间,而PRRSV攻毒组未检测到pGM-CSF蛋白,提示pGM-CSF蛋白的分泌可能具有细胞修复作用,但机理有待进一步研究。本课题建立的双抗体夹心ELISA法能够实现对样品中pGM-CSF蛋白的定量检测。综上所述,本研究成功制备抗pGM-CSF的鼠源单克隆抗体两株,分别命名为Mab-1B7E10与Mab-2A4H11,同时成功制备并纯化抗pGM-CSF的兔源多克隆抗体。以鼠源单抗作为包被抗体,兔源多抗作为检测抗体成功建立定量检测pGM-CSF的双抗体夹心ELISA方法,且确定该检测方法的特异性和敏感性。应用该检测方法对不同PRRSV毒株感染PAMs后细胞分泌pGM-CSF蛋白与PRRSV攻毒组和PRRSV攻毒+抗体治疗组的动物血清中pGM-CSF蛋白的含量进行分别测定。发现不同毒株PRRSV感染PAMs后其pGM-CSF的转录水平有显著性升高,但未检测到细胞培养上清中pGM-CSF蛋白,可能存在PRRSV感染细胞对其转录后表达的抑制机制;从PRRSV攻毒+抗体治疗组的动物血清样品中检测到pGM-CSF蛋白,其含量在1075-5025 pg/m L之间,而PRRSV攻毒组未检测到该蛋白,提示pGM-CSF的分泌可能具有细胞修复作用,但机理有待进一步研究。