研究背景及目的:胃癌是世界第五位常见恶性肿瘤,胃癌患者死亡率高,在全球恶性肿瘤死亡率中排第四位。由于胃癌发病隐匿,多数患者一经发现已处于进展期,5年总生存率不到30%。胃癌是由遗传和环境因素共同参与的多基因、多步骤的进行性疾病恶变过程,其中肠型胃癌是从正常粘膜/浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生,进而演变成胃癌。胃癌的发病机制尚未完全阐明,其发生发展与原癌基因的激活和/或肿瘤抑制基因的失活直接相关,这些基因功能的变化不仅仅与单纯基因序列变化的遗传学改变有关,目前认为表观遗传学改变对基因的表达调控也起重要作用,与胃癌的形成密切相关。表观遗传学被定义为不依赖于基因序列改变的基因表达的改变,并可遗传的一种调控机制。表观遗传的主要调节机制有:DNA甲基化,组蛋白修饰,染色质重塑,及非编码RNA等几种调节机制。DNA甲基化是基因沉默的重要机制之一。DNA甲基化主要发生于基因GC碱基的富集区（Cp G岛）,且Cp G岛常常位于基因的启动子区。健康人基因组中位于基因启动子区的Cp G岛处于非甲基化状态,某些肿瘤抑癌基因发生高度甲基化,导致基因表达沉默,最终诱发肿瘤,因此对基因启动子区甲基化进行分析可作为肿瘤早期监测和预防的重要标志物。DNA甲基化是一个相对可逆的过程,应用甲基化酶抑制剂可以逆转部分抑癌基因异常甲基化的状态,而恢复其表达和抑癌功能,为肿瘤治疗提供一种新的策略。本课题组前期通过生物信息学分析,筛选出在胃癌中高甲基化低表达的基因有445个,进一步运用蛋白相互作用网络寻找核心基因,经TCGA数据库验证后找到6个核心基因,包括SST、AR、CASR、CXCL12、GNAS、PRKACB。进一步在组织学中进行验证,结果发现在胃癌组织中SST基因m RNA表达水平明显降低,且与其启动子甲基化呈负相关趋势。生长抑素（Somatostatin,SST）是一种广泛存在于中枢神经系统、胃肠道和胰腺组织内的具有广泛生物活性的环状的多肽类激素,对人体多种激素的分泌具有重要的调节作用。人体胃窦部的D细胞具有分泌和合成SST的能力,其释放的SST主要通过旁分泌影响周围细胞的功能。SST的生物学作用主要是通过与细胞表面的生长抑素受体（SSTRs）相结合,继而活化受体后信号转导通路而产生的。目前关于胃癌SST基因甲基化与表达的相关研究很少,甲基化调控表达的分子机制尚无研究,值得我们进一步探讨。本研究前期生物信息学分析结果显示,SST在胃癌中高甲基化低表达。据此,我们推测SST可能是一个潜在的抑癌基因,由于其启动子高甲基化,导致基因表达沉默,进而引起细胞生物学行为的改变,参与胃癌的发生发展。因此本研究拟在与胃癌发生发展密切相关的不同胃疾病组织中比较观察SST蛋白水平上的差异表达,并分析蛋白表达与启动子甲基化的相关性;通过体外细胞实验证明SST基因启动子甲基化与表达的相关性,以及SST对胃癌生物学行为的影响,并进一步探讨甲基化调控表达的分子机制。本研究旨在阐明胃癌发生发展过程中SST基因启动子甲基化与表达相关性及其调控机制,为寻找新的甲基化肿瘤标志物或潜在的胃癌治疗靶点提供实验依据和理论参考。研究方法:第一部分:不同胃疾病SST基因启动子甲基化与表达的相关性研究1、收集中国医科大学附属第一医院消化内镜中心2014年8月至2017年6月接受胃镜检查患者的胃窦部活检及ESD标本186例,包括浅表性胃炎49例,萎缩性胃炎47例,异型增生44例,早期胃癌46例。2、利用免疫组化方法检测SST蛋白表达情况。3、利用BGS方法检测不同胃疾病组织中SST基因启动子甲基化水平。4、Mann-Whitney U非参数检验分析在不同胃疾病组中的SST的表达差异和启动子甲基化水平差异。Spearman等级相关系数分析SST基因启动子甲基化水平与蛋白表达的相关性。采用Graphpad Prism 8进行统计分析和图形处理。第二部分:SST过表达/沉默对不同甲基化状态胃癌细胞生物学行为的影响1、构建过表达质粒及RNAi质粒:选取pc DNA3.1（+）为载体构建SST过表达质粒-1,选取GV230为载体构建带GFP荧光的SST过表达质粒-2。选取GV248为载体,构建3个针对SST的sh RNA编码克隆。2、高甲基化低表达SST及低甲基化高表达SST胃癌细胞系的鉴定:利用Real-time PCR方法,检测SST在MGC803、HGC27、SGC7901、BGC823、AGS和MKN45胃癌细胞系中的表达量。利用BGS方法检测上述胃癌细胞系中SST基因启动子甲基化水平。3、过表达SST质粒转染:将构建的SST过表达质粒转染至所选取的高甲基化低表达SST胃癌细胞系中,利用Real-time PCR方法及Western Blot方法检测SST过表达效率。在质粒转染24h后,应用G418筛选构建过表达SST的稳转细胞株,并经Real-time PCR方法及Western Blot方法鉴定。4、沉默SST质粒转染:将构建的SST沉默质粒分别转染至低甲基化高表达SST胃癌细胞及过表达SST的稳转胃癌细胞中,利用Real-time PCR方法检测SST沉默效率。5、SST过表达/沉默细胞增殖活性的检测:利用CCK-8方法检测SST过表达/沉默对不同甲基化状态胃癌细胞增殖活性的影响。6、SST过表达/沉默细胞凋亡的检测:利用流式细胞术检测SST过表达/沉默对不同甲基化状态胃癌细胞凋亡的影响,同时利用Western Blot方法检测SST过表达/沉默对不同甲基化状态胃癌细胞凋亡蛋白PARP、Caspase 3表达的影响。7、SST过表达细胞侵袭、转移能力检测:利用Transwell方法检测SST过表达对高甲基化胃癌细胞侵袭、转移能力的影响。8、SST功能分析:利用生物信息学方法进行SST功能分析。9、统计分析:采用Graphpad Prism 8进行统计分析和图形处理。配对样本T检验比较两组表达的差异。Spearman等级相关系数分析SST基因启动子平均甲基化率与表达的相关性。第三部分:SST基因启动子甲基化影响表达的调控机制1、SST甲基化对表达的影响:分别应用5-Aza-d C去甲基化处理高甲基化AGS胃癌细胞、SAM甲基化处理低甲基化BGC823细胞,加药处理72小时后,利用BGS方法检测SST启动子甲基化水平,利用Real-time PCR方法检测SST m RNA表达水平。2、启动子活性检测:利用双萤光素酶报告基因系统检测SST启动子区甲基化对SST启动子活性的影响。3、SST启动子差异甲基化位点靶向结合的转录因子预测:利用JASPAR数据库预测并筛选与SST启动子差异甲基化位点结合的转录因子。4、启动子与转录因子结合能力检测:利用EMSA实验检测胃癌细胞SST启动子特异甲基化位点不同甲基化状态下与转录因子的结合能力。5、SST启动子特异甲基化位点与转录因子结合对SST启动子活性的影响:利用双萤光素酶报告基因系统检测SST启动子特异甲基化位点与转录因子结合对SST启动子活性的影响。6、统计分析:采用Graphpad Prism 8进行统计分析和图形处理。以配对样本T检验比较两组的差异表达。研究结果:第一部分:不同胃疾病SST基因启动子甲基化与表达的相关性研究1、免疫组织化学方法证实SST的表达在浅表性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-早期胃癌逐渐演变过程中逐渐下降,阳性表达率分别为15.02%,3.68%,1.74%,0.05%。任意两组间表达差异均有统计学意义（P<0.05）。2、BGS方法证实与相对于非胃癌组（60.2%±6.69%）,胃癌组中SST基因启动子区平均甲基化率升高（63.16%±4.94%）（P<0.05）,其中18、20、21、22号位点（+100bp、+127bp、+129bp、+138bp）的甲基化率显著升高（P<0.05）。3、SST启动子区平均甲基化率与其蛋白表达具有负相关趋势（r=-0.156,P=0.039）,4个差异位点中20、21号位点（+127bp、+129bp）甲基化率与蛋白表达具有负相关趋势（r分别为-0.156,-0.165,P分别为0.039,0.029）。第二部分:SST过表达/沉默对不同甲基化状态胃癌细胞生物学行为的影响1、细胞鉴定:利用Real-time PCR和BGS方法,鉴定出相对高甲基化低表达SST胃癌细胞系AGS和低甲基化高表达SST胃癌细胞系BGC823,同时Spearman等级相关系数分析结果显示SST启动子甲基化水平与其m RNA表达呈负相关趋势（r=-0.371,P=0.50）。2、SST过表达对细胞增殖活性的影响:CCK-8实验结果显示与对照组相比,SST过表达组抑制高甲基化AGS细胞增殖活性,同样,SST过表达的稳转AGS细胞组的增殖活性也减弱。3、SST沉默对细胞增殖活性的影响:分别在低甲基化BGC823细胞和SST过表达的稳转AGS细胞中沉默SST,CCK-8实验结果均显示与对照组相比,SST沉默后胃癌细胞增殖活性均增强。4、SST过表达/沉默对细胞凋亡的影响:流式细胞术结果显示高甲基化AGS胃癌细胞过表达SST后,细胞凋亡率较对照组升高（P<0.05）;低甲基化BGC823胃癌细胞沉默SST后,细胞凋亡率较对照组降低（P<0.05）。Western Blot实验结果显示过表达SST的高甲基化AGS胃癌细胞中,凋亡蛋白PARP及Caspase 3的表达较对照组无明显差异,沉默SST的低甲基化BGC823胃癌细胞中,凋亡蛋白PARP及Caspase 3的表达较对照组也无明显差异。5、SST过表达对细胞侵袭、转移能力的影响:Transwell实验结果显示,过表达SST的高甲基化AGS胃癌细胞的侵袭细胞数及转移细胞数较对照组均无明显差异（P>0.05）。6、SST功能分析:利用TCGA-STAD数据集进行GSEA富集分析,KEGG富集结果中见调控细胞增殖的PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路,同样,利用CCLE数据库胃癌细胞数据集进行KEGG功能富集分析,富集结果中也见PI3K-Akt信号通路。第三部分:SST基因启动子甲基化影响表达的调控机制1、去甲基化/甲基化处理胃癌细胞结果:应用5-Aza-d C去甲基化处理高甲基化AGS胃癌细胞,结果显示与对照组相比,5-Aza-d C处理组SST启动子平均甲基化率下降14.25%（90.73%vs 76.48%）（P<0.05）,SST基因m RNA表达水平上调4倍(1.0×10-7vs 4.22×10-7)（P<0.05）;应用SAM甲基化处理低甲基化BGC823细胞,结果显示与对照组相比,SAM处理组SST启动子平均甲基化率上升9.07%（84.57%vs 93.64%）（P<0.05）,SST基因m RNA表达水平下调了53.52%(2.84×10-6vs 1.32×10-6)（P<0.05）。2、双萤光素酶实验结果:与正常SST启动子相比,甲基化处理后的启动子荧光素酶活性显著降低（P<0.05）。3、转录因子预测分析结果:利用JASPAR数据库预测与SST启动子20、21号差异甲基化位点（+127bp、+129bp）结合的转录因子,从中筛选出2个评分较高的转录因子CTCFL及SOX18,进行后续实验。4、EMSA实验结果:与非甲基化相比,SST启动子20、21号位点（+127bp、+129bp）甲基化状态下与转录因子CTCFL及SOX18的结合均减弱。5、双萤光素酶实验结果:过表达转录因子CTCFL后,SST启动子全长野生型、Cp G岛截断野生型、Cp G岛截断20、21号甲基化位点突变型的活性均增强（P<0.05）,与20、21号甲基化位点突变型相比,SST启动子野生型的活性增强更明显。过表达转录因子SOX18后,SST启动子全长野生型、Cp G岛截断野生型、Cp G岛截断20、21号甲基化位点突变型的活性均减弱（P<0.05）。结论:1、SST蛋白表达与胃癌发生发展负相关;SST表达与胃癌细胞增殖活性负相关,过表达SST抑制高甲基化胃癌细胞增殖,沉默SST促进低甲基化胃癌细胞增殖;SST表达可能与胃癌细胞凋亡相关。2、胃癌组织SST启动子平均甲基化率高于非胃癌组织,启动子区18、20、21、22号位点（+100bp、+127bp、+129bp、+138bp）的甲基化率显著升高。3、SST基因启动子甲基化可影响其表达。SST启动子20、21号（+127bp、+129bp）位点甲基化可抑制其与转录因子CTCFL结合,进而抑制SST启动子活性,沉默SST基因表达。