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目的：
1.观察尘螨抗原(HDM)对HMC-1人肥大细胞Toll样受体9(TLR9)、TLR4及其mRNA和下游通路胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的作用，以及对白介素4(IL-4)分泌的影响，探讨HDM对人肥大细胞(MCs)的直接作用及其作用机理。
2.观察CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)对HDM直接作用HMC-1人肥大细胞后TLR4和TLR9受体及其mRNA、ERK1/2、PI3K表达及IL-4分泌的影响，探讨CpGODN对人MCs的免疫调节机制。
3.观察使用TLR9-siRNA后ERK1/2和IL-4的表达情况,探讨CpGODN是否通过上调TLR9，下调ERK1/2的表达发挥对HMC-1人肥大细胞的保护作用。
方法：
1.尘螨抗原直接作用HMC-1人肥大细胞：将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中，经24h培养后改用无血清的培养基继续培养5h，根据尘螨抗原浓度不同分成空白对照组(a组)、HDM0.001μg/ml(b组)、HDM0.005μg/ml(c组)、HDM0.01μg/ml(d组)，HDM0.025μg/ml(e组),HDM0.05μg/ml(f组)培养24h。蛋白免疫印迹(WB)法检测各组中TLR4、TLR9蛋白的表达情况及ERK1/2磷酸化水平1、RT-PCR检测TLR4、TLR9mRNA的变化情况。
2.CpGODN单独或联合尘螨抗原直接作用HMC-1细胞：将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中,经24h培养后改用CpGODN预处理5h,再用HDM0.05ug/ml刺激24h，分成4组：空白对照组(A组)，HDM0.05μg/ml组(B组)，CpGODN0.5μmol/l(C组)，HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(D组),蛋白免疫印迹(WB)法检测各组TLR4、TLR9的蛋白表达情况及ERK1/2磷酸化水平2、RT-PCR检测TLR4、TLR9mRNA的变化情况,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子IL-4的表达量。
3.使用TLR9-siRNA后观察CpGODN对于尘螨直接刺激的保护作用:将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中,经24h培养后改用CpGODN预处理5h,同时加入100nMTLR9-siRNA后再用HDM0.05ug/ml刺激24h，分成3组：HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(A组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA(B组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+NCsiRNA(C组),探讨CpGODN是否通过上调TLR9,下调ERK1/2的表达发挥对人MCs的保护作用。
结果：
1.尘螨抗原直接作用HMC-1细胞
1.1不同浓度HDM作用HMC-1细胞24h后TLR4、TLR9的蛋白和mRNA表达变化
不同浓度HDM(0μg/ml、0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml)直接作用HMC-1细胞24h后与空白对照组相比较，HDM作用24h后，0.05μg/ml组TLR4mRNA的表达显著下降(P＜0.05),0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml组TLR4蛋白的表达显著下降(P均＜0.05)；0.01μg/ml组和0.05μg/ml组细胞TLR9mRNA显著下降(P均＜0.05)；0.05μg/ml组细胞TLR9蛋白表达显著下降(P＜0.05)与空白对照组比较；HDM作用24h后，0.05μg/ml组TLR4、TLR9mRNA和蛋白均存在显著性变化，且组间无明显浓度依赖性。
1.2不同浓度HDM作用HMC-1细胞24h后通路ERK1/2磷酸化水平变化
WB结果示：与空白对照组比较，HDM作用24h后，0.005ug/ml、0.01ug/ml、0.025ug/ml、0.05μg/ml组细胞的ERK1/2蛋白磷酸化水平显著升高(p＜0.05或p＜0.01)，0.001μg/ml组无显著改变(P＞0.05)。
2.CpGODN对尘螨抗原直接作用HMC-1细胞的干预和影响
分成4组，空白对照组(A组)，HDM0.05μg/ml组(B组)，CpGODN0.5μmol/l(C组)，HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(D组),
2.1CpGODN单独或联合HDM作用HMC-1细胞24h后TLR9和TLR4的蛋白表达和mRNA变化情况。
WB结果示：与HDM0.05ug/ml组相比较，C组和D组TLR9mRNA表达量显著上调(p＜0.01或p＜0.001)，D组TLR9蛋白表达存在显著性(p＜0.05)；B组TLR4mRNA和蛋白表达量均显著变化(p＜0.01或p＜0.05)。
2.2CpGODN单独或联合HDM作用HMC-1细胞24h后通路ERK1/2的磷酸化水平变化和IL-4的变化情况。
WB结果示：与HDM0.05ug/ml组比较，D组ERK1/2磷酸化水平和IL-4均显著降低(p＜0.01和p＜0.05)。
3.使用TLR9-siRNA后观察CpGODN对于尘螨直接刺激的保护作用
分成3组：HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(A组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA(B组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+NCsiRNA(C组)
WB结果示：与HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA比较，C组ERK1/2磷酸化水平降低
结论：
1.尘螨抗原可经非IgE介导途径直接激活HMC-1细胞，上调TLR4mRNA和蛋白，下调TLR9mRNA和蛋白水平，并能活化ERK1/2信号通路从而促进炎症及过敏反应的发生与发展，但对PI3K信号通路的影响不大。
2.CpGODN（B型）可上调HMC-1细胞TLR9mRNA和蛋白表达，下调HDM引起的ERK1/2和IL-4的释放，故其保护作用主要通过TLR9受体,从而稳定肥大细胞，发挥抗炎作用。
3.CpGODN对尘螨刺激肥大细胞的免疫调节机制可能是通过抑制TLR9受体的下调及ERK1/2信号通路的活化，但其不能下调尘螨抗原引起的TLR4mRNA和蛋白的变化。
1.观察尘螨抗原(HDM)对HMC-1人肥大细胞Toll样受体9(TLR9)、TLR4及其mRNA和下游通路胞外信号调节激酶(ERK1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的作用，以及对白介素4(IL-4)分泌的影响，探讨HDM对人肥大细胞(MCs)的直接作用及其作用机理。
2.观察CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)对HDM直接作用HMC-1人肥大细胞后TLR4和TLR9受体及其mRNA、ERK1/2、PI3K表达及IL-4分泌的影响，探讨CpGODN对人MCs的免疫调节机制。
3.观察使用TLR9-siRNA后ERK1/2和IL-4的表达情况,探讨CpGODN是否通过上调TLR9，下调ERK1/2的表达发挥对HMC-1人肥大细胞的保护作用。
方法：
1.尘螨抗原直接作用HMC-1人肥大细胞：将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中，经24h培养后改用无血清的培养基继续培养5h，根据尘螨抗原浓度不同分成空白对照组(a组)、HDM0.001μg/ml(b组)、HDM0.005μg/ml(c组)、HDM0.01μg/ml(d组)，HDM0.025μg/ml(e组),HDM0.05μg/ml(f组)培养24h。蛋白免疫印迹(WB)法检测各组中TLR4、TLR9蛋白的表达情况及ERK1/2磷酸化水平1、RT-PCR检测TLR4、TLR9mRNA的变化情况。
2.CpGODN单独或联合尘螨抗原直接作用HMC-1细胞：将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中,经24h培养后改用CpGODN预处理5h,再用HDM0.05ug/ml刺激24h，分成4组：空白对照组(A组)，HDM0.05μg/ml组(B组)，CpGODN0.5μmol/l(C组)，HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(D组),蛋白免疫印迹(WB)法检测各组TLR4、TLR9的蛋白表达情况及ERK1/2磷酸化水平2、RT-PCR检测TLR4、TLR9mRNA的变化情况,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子IL-4的表达量。
3.使用TLR9-siRNA后观察CpGODN对于尘螨直接刺激的保护作用:将HMC-1细胞接种至6cm培养皿中,经24h培养后改用CpGODN预处理5h,同时加入100nMTLR9-siRNA后再用HDM0.05ug/ml刺激24h，分成3组：HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(A组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA(B组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+NCsiRNA(C组),探讨CpGODN是否通过上调TLR9,下调ERK1/2的表达发挥对人MCs的保护作用。
结果：
1.尘螨抗原直接作用HMC-1细胞
1.1不同浓度HDM作用HMC-1细胞24h后TLR4、TLR9的蛋白和mRNA表达变化
不同浓度HDM(0μg/ml、0.001μg/ml、0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml)直接作用HMC-1细胞24h后与空白对照组相比较，HDM作用24h后，0.05μg/ml组TLR4mRNA的表达显著下降(P＜0.05),0.005μg/ml、0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml组TLR4蛋白的表达显著下降(P均＜0.05)；0.01μg/ml组和0.05μg/ml组细胞TLR9mRNA显著下降(P均＜0.05)；0.05μg/ml组细胞TLR9蛋白表达显著下降(P＜0.05)与空白对照组比较；HDM作用24h后，0.05μg/ml组TLR4、TLR9mRNA和蛋白均存在显著性变化，且组间无明显浓度依赖性。
1.2不同浓度HDM作用HMC-1细胞24h后通路ERK1/2磷酸化水平变化
WB结果示：与空白对照组比较，HDM作用24h后，0.005ug/ml、0.01ug/ml、0.025ug/ml、0.05μg/ml组细胞的ERK1/2蛋白磷酸化水平显著升高(p＜0.05或p＜0.01)，0.001μg/ml组无显著改变(P＞0.05)。
2.CpGODN对尘螨抗原直接作用HMC-1细胞的干预和影响
分成4组，空白对照组(A组)，HDM0.05μg/ml组(B组)，CpGODN0.5μmol/l(C组)，HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(D组),
2.1CpGODN单独或联合HDM作用HMC-1细胞24h后TLR9和TLR4的蛋白表达和mRNA变化情况。
WB结果示：与HDM0.05ug/ml组相比较，C组和D组TLR9mRNA表达量显著上调(p＜0.01或p＜0.001)，D组TLR9蛋白表达存在显著性(p＜0.05)；B组TLR4mRNA和蛋白表达量均显著变化(p＜0.01或p＜0.05)。
2.2CpGODN单独或联合HDM作用HMC-1细胞24h后通路ERK1/2的磷酸化水平变化和IL-4的变化情况。
WB结果示：与HDM0.05ug/ml组比较，D组ERK1/2磷酸化水平和IL-4均显著降低(p＜0.01和p＜0.05)。
3.使用TLR9-siRNA后观察CpGODN对于尘螨直接刺激的保护作用
分成3组：HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l(A组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA(B组),HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+NCsiRNA(C组)
WB结果示：与HDM0.05μg/ml+CpGODN0.5μmol/l+TLR9siRNA比较，C组ERK1/2磷酸化水平降低
结论：
1.尘螨抗原可经非IgE介导途径直接激活HMC-1细胞，上调TLR4mRNA和蛋白，下调TLR9mRNA和蛋白水平，并能活化ERK1/2信号通路从而促进炎症及过敏反应的发生与发展，但对PI3K信号通路的影响不大。
2.CpGODN（B型）可上调HMC-1细胞TLR9mRNA和蛋白表达，下调HDM引起的ERK1/2和IL-4的释放，故其保护作用主要通过TLR9受体,从而稳定肥大细胞，发挥抗炎作用。
3.CpGODN对尘螨刺激肥大细胞的免疫调节机制可能是通过抑制TLR9受体的下调及ERK1/2信号通路的活化，但其不能下调尘螨抗原引起的TLR4mRNA和蛋白的变化。