论文部分内容阅读
精氨酸脱亚氨基酶（Argininedeiminase，EC3.5.3.6;ADI）催化L-精氨酸水解为L-瓜氨酸和氨，与鸟氨酸氨甲酰转移酶、氨基甲酸激酶共同组成精氨酸脱亚氨基酶途径，广泛分布于一些以精氨酸为主要能量来源的细菌、古细菌及少数低等真核生物中。精氨酸脱亚氨基酶除了可用于酶法生产L-瓜氨酸外，还被证明是一种潜在的抗癌药物，可有效抑制精氨酸缺陷型肿瘤细胞的生长（如黑色素瘤、肝癌细胞），抗白血病作用等，在医疗领域具有广阔的应用前景。目前，研究人员已经在大肠杆菌中克隆表达了来源于支原体(Mycoplasma)、假单胞菌（Pseudomonasplecoglossicida）、链球菌（Streptococcussanguis）、贾第鞭毛虫（GiardiaIntestinalis）等微生物的ADI基因。但是，它们在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在，活性较低，不利于大规模工业生产L-瓜氨酸及作为抗肿瘤制剂的研究。 本文分别选取生活环境差异显著的云南腾冲嗜热杆菌（ThermoanaerobactertengcongensisMB4）、恶臭假单胞菌（PseudomonasputidaATCC4359）及威尔李斯特菌(Listeriawelshimeriserovar6bstr.SLCC5334P)的ADI基因序列，分别命名为TADI、PADI、LADI。同源性比对结果显示:三种ADI的氨基酸序列之间差异较大，同源性较低，暗示其可能存在较为显著的性质差异，有利于发掘新颖特性，应用于酶法制备L-瓜氨酸及抗肿瘤制剂研究。 在大肠杆菌系统中，通过构建多种不同类型的表达载体，优化培养条件，三种重组蛋白仍主要以无活性的包涵体形式存在。通过探索，本论文发现了一种新的促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法。在分子伴侣GroEL-GroES共表达的基础上，在LB培养基中通过添加0.5％D-葡萄糖和0.5％L-精氨酸进行共诱导培养，可分别使rPADI、rLADI的水溶性产量显著提高至15、7倍。然而，rTADI蛋白通过截短表达、体外复性、分子伴侣共表达等多种优化策略均未能获得活性蛋白。 通过镍柱亲和层析纯化得到天然的rPADI和rLADI蛋白，分别对其进行了酶学性质研究。rPADI的最适温度为40℃，最适pH为6.0，比酶活为76±0.03U/mg，Km值为0.34mM，水溶性产量可达到45-50mg/L，其催化能力及水溶性产量均位于文献报道的中上游水平。rLADI的最适温度为45℃，最适pH为6.0，比酶活为3.12±0.01U/mg，Km值为46.2mM。Cr3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Hg2+、SDS、DTT可强烈抑制rLADI的活性。温度和pH的轻微变化，金属离子及化学试剂的存在均会显著影响rLADI的催化能力。鉴于rPADI在水溶性、催化能力等方面的优势，本文利用rPADI的粗酶液直接进行L-瓜氨酸的转化研究，发现25ml重组菌体制备的粗酶液可将20gL-精氨酸有效转化为L-瓜氨酸，转化率高于90％，具有潜在的应用价值。 探寻高水溶性及高催化能力的精氨酸脱亚氨基酶，已成为酶法生产L-瓜氨酸及抗肿瘤细胞研究的热点。在本论文中，我们成功获得了具有较优水溶性及催化能力的rPADI，具有一定的应用潜力，并发现了一种有效促进重组精氨酸脱亚氨基酶活性表达的新方法，也为其他重组蛋白在大肠杆菌中的活性表达提供了一个新的优化策略。