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目的：1.体外实验探讨熊果酸(ursolic acid, UA)对人肝癌HepG2、Bel-7402细胞生长抑制的分子作用机制。2.动物实验探讨熊果酸对人肝癌HepG2裸鼠移植瘤生长和对肝癌裸鼠移植瘤相关蛋白表达的影响,初步了解熊果酸体内抗肝癌机制。方法：1.采用四甲基偶氮甲唑盐比色(MTT)方法检测UA对Bel-7402肝癌细胞的24h,48 h和72 h的细胞生存率作用。同时观察UA对多种肝癌细胞的抑制作用。采用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)检测UA对Bel-7402和HepG2肝癌细胞24h周期的影响；蛋白质免疫印迹(Western blot, WB)法检测UA对Bel-7402和HepG2肝癌细胞p38MAPK磷酸化蛋白的表达；剂量依赖性的检测UA作用于Bel-7402和HepG2肝癌细胞24 hFOXO3a、IGFBP1蛋白表达情况；然后通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测IGFBP1 mRNA表达水平；双荧光素酶报告基因法检测UA对Bel-7402和HepG2肝癌细胞IGFBP1启动子活性；采用p38MAPK抑制剂SB203580,进一步研究UA通过p38MAPK对FOXO3a、IGFBP1蛋白表达的影响以及对IGFBP1启动子活性的作用。采用沉默(RNA干扰)和过表达技术进行细胞瞬时转染的方法,研究UA对肝癌的细胞生长抑制作用以及对FOXO3a、IGFBP1蛋白表达的影响； 2.体内药效研究,带荧光素酶的HepG2细胞造肝癌裸鼠腋下移植瘤模型,成瘤后,根据裸鼠体重与肿瘤体积的大小,进行随机化分组,然后将其分为三组：空白对照组；熊果酸低剂量组(25 mg.kg-1.d-1，腹腔注射,连续用药30天)；熊果酸高剂量组(50 mg.kg-1.d-1,腹腔注射,连续用药30天)。用小动物活体成像技术观察给予熊果酸低剂量和高剂量处理后移植瘤体重荧光素酶标记的HepG2细胞增殖情况；到达作用时间后,测量肿瘤体积、肿瘤大小和称量裸鼠、肿瘤的重量。提取肿瘤组织蛋白后,采用Western bolt法观察高剂量熊果酸处理后裸鼠移植瘤组织p-p38MAPK、FOXO3a和IGFBP1蛋白表达的变化。结果：体外实验：1.MTT法结果表明,熊果酸对肝癌细胞Be1-7402具有显著性的抑制作用,呈剂量依赖性,和对照组比较,浓度在15～30μM时,差异具有统计学意义(p<0.05)。24h熊果酸的IC50=23.04±0.68μM,48 h的IG50=22.845±0.875μM,72 h的IG50=21.525±1.245μM。熊果酸对多种肝癌细胞包括HepG2、Bel-7402、QJY-7703、 MHCC97L和MHCC97H,在一定的时间和剂量下具有不同的抑制效果,和对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。细胞瞬时转染方法结果显示,沉默FOX03a可以逆转熊果酸对Bel-7402、HepG2肝癌细胞的生长抑制作用。沉默IGFBP1可以逆转熊果酸对Bel-7402、HepG2肝癌细胞的生长抑制作用。先沉默IGFBP1,然后再过表达IGFBP1,可以修复熊果酸对Bel-7402、HepG2肝癌细胞的生长抑制作用,加药组和未转染加药组之间,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.流式细胞术结果发现熊果酸可诱导Bel-7402、HepG2肝癌细胞发生G0／G1期阻滞。在Bel-7402细胞中,G0／G1期细胞比例在20 μM、25μM处理时上升,20～25 μM UA在G0／G1期百分率分别为73.968±2.24和77.81±2.49。在HepG2细胞中,G0／G1期细胞比例在5μM20μM和25μM处理时上升,5～25μMUA在G0／G1期百分率分别为60.19±0.42、74.89±1.32和75.06±1.32,与对照组比较具有统计学意义(p<0.05)。3. Westernblot法检测蛋白表达结果显示熊果酸可以时间依赖性的增加P38MAPK的磷酸化。对于Bel-7402和HepG2肝癌细胞,熊果酸24 h可以剂量依赖性的增加IGFBP1、FOX03a蛋白的表达,和对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.qRT-PCR法检测在Bel-7402、HepG2肝癌细胞中,熊果酸可以增加IGFBP1 mRNA的基因表达量,和对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.双荧光素酶报告基因法检测在Bel-7402、HepG2肝癌细胞中,熊果酸可以增强IGFBP1启动子的活性,和对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.Western blot法和双荧光素酶报告基因法结果显示给予P38MAPK抑制剂干预可以阻断熊果酸导致Bel-7402和HepG2肝癌细胞中IGFBPU FOX03a的上调以及IGFBP1启动子活性的增加。熊果酸单独给药组和熊果酸联合抑制剂组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。在肝癌Bel-7402、HepG2细胞中,沉默IGFBP1基因可以逆转熊果酸对FOXO3a的上调影响,而沉默FOX03a基因,并不能逆转熊果酸对IGFBP1的上调影响。7.细胞瞬时转染法和Western blot法结果表明在Bel-7402、HepG2肝癌细胞中,过表达IGFBP1基因可以增强熊果酸对p-p38MAPK, FOX03a的上调影响,过表达FOX03a基因可以增强熊果酸对p-p38MAPK的上调影响,给药组和未转染给药组相比,差异具有统计学意义(p<0.05),但对IGFBP1的作用无明显影响。体内实验：1.动物实验结果表明,与对照组相比,高剂量熊果酸组能使HepG2移植瘤裸鼠的瘤体和瘤重变小,差异具有统计学意义(p<0.05)。对裸鼠重量无明显变化,因此,熊果酸在体内亦能抑制HepG2肝癌细胞的生长。2.在HepG2移植瘤裸鼠肿瘤组织中,高剂量熊果酸可以增强p-p38MAPK、FOX03a和IGFBP1蛋白的表达,和对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论：1.体外实验表明,熊果酸可以通过活化P38MAPK激酶途径,从而增加Bel-7402、HepG2肝癌细胞中IGFBP1和转录因子FOX03a蛋白的表达,并且可以使Bel-7402、HepG2细胞停滞于G0／G1期。同时,增加p38MAPK磷酸化可以增强IGFBP1和FOX03a蛋白的表达。过表达IGFBP1和FOX03a可以反馈协同熊果酸对p38MAPK的刺激作用,此反馈调节环路进一步提示IGFBP1和FOX03a的表达在介导熊果酸抑制肝癌细胞生长机制中的重要作用；2.通过建立皮下HepG2裸鼠移植瘤肿瘤模型,体内实验观察和体外实验结果一致,进一步证实了p38MAPK激酶活性介导上调IGFBP1以及FOX03a的蛋白表达在熊果酸抑制肝癌细胞生长过程中的重要调控作用；3.综合体内、体外实验研究,共同阐释了UA抑制肝癌细胞生长潜在的新颖的分子机制以及证明了IGFBP1和FOX03a可能是治疗肝癌潜在的分子靶点。