论文部分内容阅读
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽胞期产生的晶体蛋白(Cry)对多种昆虫和线虫具有毒杀活性。目前对Cry蛋白杀昆虫机制研究已经比较清楚,对杀线虫机制的研究却非常少。目前已证明在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)中糖脂是Cry5Ba的受体。在Cry蛋白杀昆虫“穿孔模式”机制基础上,本实验室也证明了 C.elegans中钙黏蛋白也是Cry5Ba的受体。但在验证氨肽酶(昆虫中Cry蛋白的第二受体)是否是Cry5Ba受体时,意外发现金属蛋白酶类似物MNP-1,其突变体RB1884对Cry5Ba超敏,预测MNP-1可能参与宿主对Cry5Ba毒素的防御。鉴于MNP-1是首次发现与宿主防御相关,可能存在一种全新的防御方式,因此本研究对MNP-1介导的宿主防御机制展开了研究,并证明了以下结论:1.MNP-1 调控 insulin-like 信号通路参与 C.elegans 防御 PFTs我们发现突变体RB1884(mnp-1)对其他杀线虫Cry蛋白如Cry6Aa、Cry14Aa和Cry21Aa等也具有超敏表型,但对过氧化氢和硫酸铜等毒素却无超敏表型,同时Cry蛋白(Cry5Ba、Cry14Aa)处理后,mnp-1基因会特异性转录上调,推测MNP-1参与宿主特异性防御Cry蛋白类穿孔毒素(Pore Forming Toxins,PFTs)。为进一步研究MNP-1如何参与C.elegans防御PFTs,我们通过基因芯片发现Cry5Ba处理下,C.elegans中大量防御效应因子如溶菌酶抗菌肽等发生显著上下调,其中有超过122个防御效应因子与mnp-1正相关,说明这些效应因子受到MNP-1的调节。已报道这些防御相关效应因子大都受天然免疫信号通路的调节,我们进一步通过qRT-PCR,生物测定和报告线虫等证实MNP-1可调控insulin-like信号通路,具体调控方式为:MNP-1位于DAF-2上游,一方面可负调控DAF-2,同时正调控DAF-2上游拮抗剂神经肽INS-1,促进DAF-16转录因子定位于细胞核,进一步激活大量防御效应因子的转录和表达,最终起到防御Cry5Ba的效果。2.MNP-1调节蛋白酶类效应因子帮助宿主降解Cry5Ba毒素虽然目前已有报道多种天然免疫信号通路参与宿主防御PFTs,但是还没有关于宿主如何降解和清除PFTs的报道。生物芯片富集分析发现大量差异表达基因与蛋白水解以及泛素化反应相关,而这些生物过程都与蛋白降解相关;同时受MNP-1调节变化最为显著的效应因子中有11个为蛋白水解酶类。因此推测MNP-1可能调节宿主蛋白酶表达水平帮助宿主降解Cry5Ba毒素。首先利用突变体和RNAi的生物测定证明这些蛋白酶确实参与C.elegans防御Cry5Ba;qRT-PCR证明这11个蛋白酶效应因子有7个受到DAF-2/DAF-16信号通路的调控;线虫粗提液与Cry5Ba共同孵育后,发现mnp-l突变体和DAF-2/DAF-16信号通路关键基因突变体对毒素的降解程度均显著弱于野生型N2;同时蛋白酶突变体F19C6.4和R03G8.4对Cry5Ba降解均显著弱于野生型N2,证明MNP-1调节的防御相关蛋白酶确实参与Cry5Ba的降解。3.MNP-1调控多条天然免疫信号通路并参与宿主防御病原菌入侵已报道参与C.elegans防御Cry5Ba有多种天然免疫信号通路,我们进一步通过qRT-PCR和生物测定等实验证明MNP-1也可调控p38 MAPK和JNK MAPK等信号通路,但还需进一步实验辅证。此外,我们还发现MNP-1介导的防御反应可以帮助宿主抵御病原菌的入侵,如粘质沙门氏菌和粪肠球菌等。同时,生物信息学分析发现MNP-1同源基因广泛存在于从真菌到高等动物甚至人类的基因组中,暗示MNP-1可能是从真菌到人类都保守存在的天然免疫关键基因。本研究揭示了金属蛋白酶类似物MNP-1是C.elegans中一种全新的天然免疫关键基因,可调控DAF-2/DAF-16,p38MAPK和JNKMAPK等多种天然免疫信号通路,参与宿主防御PFTs和病原菌的入侵。本研究同时也提出了 MNP-1调节C.elegans防御蛋白酶水平降解蛋白类毒素的防御新机制。本研究的发现为我们更深入理解Cry蛋白与宿主的相互作用机制提供了新的视角。同时也为线虫甚至高等动物与毒素和病原菌的相互作用提供了新的认识。