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寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zika Virus,ZIKV）引起的一种人兽共患传染病,2015年在全球范围内传播,导致新生儿出现先天性寨卡综合征、成人出现格林-巴雷综合征等症状。2015年12月1日,世界卫生组织（World Health Organization,WHO）和泛美卫生组织联合发布了关于寨卡病毒病的全球警告。2016年11月,WHO宣布寨卡病毒病疫情不再是国际关注的突发公共卫生事件,但仍是一个重大且持续的公共卫生问题;ZIKV已被列入“预防传染病研发行动蓝图”中,2018年2月,WHO将寨卡病毒病列为优先研究的疾病之一。近年来我国已有寨卡病毒病的输入。由于疫情可能会反复暴发,并且尚无上市的药物和疫苗,因此,研制安全、高效的寨卡疫苗,对于有效应对疫情暴发,保障人类健康和公共卫生安全具有重要意义。本文分别以狂犬病病毒（Rabies Virus,RABV）和革兰氏阳性增强基质（Gram Positive Enhancer Matrix,GEM）为载体研制了寨卡病毒基因重组RABV和细菌样颗粒,并评价其免疫效果,以期为寨卡病毒病的免疫预防提供技术和产品支持。本研究以RABV SRV9株反向遗传操作系统为基础,构建了3种携带ZIKV pr M-E基因的重组RABV,分别命名为ZI-D、ZI-E和ZI-F。其中,ZI-D中的pr M-E基因未经改动;ZI-E中pr M-E基因的跨膜区被替换成SRV9 G基因的跨膜区-胞内区;ZI-F中pr M-E的信号肽、跨膜区被替换成SRV9 G基因的信号肽、跨膜区-胞内区。激光共聚焦结果显示:在ZI-D、ZI-E感染的细胞中均可检测到RABV G蛋白、ZIKV E蛋白的表达,且ZI-E感染的细胞表面有大量的ZIKV E蛋白,可与RABV G蛋白共定位;ZI-F只能检测到RABV G蛋白。免疫电镜可见ZI-D、ZI-E周围有ZIKV E蛋白标记的金颗粒。纯化的ZI-D、ZI-E经Western-blot可检测到ZIKV E蛋白条带,且ZI-E的ZIKV E蛋白表达量高于ZI-D的表达量;ZI-F中未检测到ZIKV E蛋白的表达。病毒生长曲线显示,ZI-D、ZI-E的体外增殖与母本病毒无显著差异;ZI-D、ZI-E连续传至25代后ZIKV E基因PCR检测仍为阳性。综上所述,成功筛选获得2株表达ZIKV pr M-E蛋白的重组RABV:ZI-D、ZI-E,重组病毒具有良好的遗传稳定性,外源蛋白的表达不影响重组病毒的体外生长,病毒滴度可达108.63 TCID50/m L。将ZI-D和ZI-E以β-丙内酯灭活、纯化后,辅以ISA 201 VG＆poly（I:C）佐剂制备疫苗,免疫小鼠,检测细胞免疫和体液免疫应答。结果表明,疫苗免疫可刺激小鼠产生ZIKV特异性Ig G抗体,抗体类型为Th2型;免疫后第6周,两组小鼠血清的ZIKV中和抗体效价均值分别为1:19.8、1:25.6,均在文献报道的保护水平线(PRNT50值＞1:10)以上。同时,免疫组小鼠血清RABV中和抗体效价均高于23.38 IU/m L,也在保护水平线（0.5 IU/m L）以上。在首免后第3、6天,ZI-D、ZI-E组小鼠腹股沟淋巴结内活化的B淋巴细胞显著增多。三免后1周,ZI-D、ZI-E组脾细胞有显著增殖;分泌IFN-γ、IL-4因子的脾淋巴细胞数显著增多,且ZI-E组分泌IL-4的脾细胞数高于ZI-D组;脾淋巴细胞分泌的Th1源细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF-α）和Th2源细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6和IL-10）均有不同程度的提高。此外,与ZI-D组和对照组相比,ZI-E组的CD4+T/CD8+T细胞、B细胞的活化程度（CD4+/CD8+/CD19+＆CD69+）均显著升高,中央记忆性T细胞比例（CD4+/CD8+＆CD44+＆CD62L+）也显著增加。综上所述,ZI-E可诱导机体产生针对ZIKV特异性的体液免疫和细胞免疫应答,并可产生高水平的RABV中和抗体。本研究还利用GEM-PA展示技术制备了ZIKV细菌样颗粒。首先构建表达ZIKV pr M-E和PA3融合蛋白的重组杆状病毒,结果表明,去除pr M-E基因颈区-跨膜区（Stem-Transmembrane,ST-TM）后,融合蛋白可分泌到培养液上清中,并成功结合在GEM表面。含有pr M-E基因ST-TM的融合蛋白不能分泌到培养液上清中,仅能在超声后细胞上清中检测到大小不一的条带,且不能有效结合在GEM表面。随后,将3种可分泌表达的融合蛋白（信号肽分别来源于ZIKV pr M-E、乙型脑炎病毒pr M-E和杆状病毒GP67蛋白）分别与GEM结合制备细菌样颗粒,免疫荧光和Western-blot结果显示:ZIKV E蛋白均成功展示在GEM表面。综上所述,成功获得3种能将ZIKV E蛋白展示在GEM表面的ZIKV细菌样颗粒,分别命名为ZI-△-PA-GEM、ZI-JE-△-PA-GEM和ZI-GP-△-PA-GEM。将3种ZIKV细菌样颗粒辅以ISA 201 VG＆poly（I:C）佐剂制备疫苗,免疫小鼠评价其免疫效果。ZIKV抗体检测结果显示:疫苗免疫后可刺激机体产生Th2型的抗ZIKV Ig G抗体;首免后6周中和抗体平均值均在1:24.9以上。细胞免疫应答结果显示:首免后第3、6天,免疫组小鼠腹股沟淋巴结内活化的B淋巴细胞数量显著增多;第6、9天树突状细胞有明显的活化。小鼠三免后1周,免疫组脾细胞有明显的增殖,且ZI-△-PA-GEM组增殖数最高。ELISpot检测结果显示:与对照组相比,免疫组小鼠脾中分泌IFN-γ、IL-4因子的淋巴细胞数显著增加,且ZI-△-PA-GEM组的细胞数最多;脾淋巴细胞分泌到上清中的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10也均有不同程度的增加。ZI-△-PA-GEM组的CD4+T/CD8+T细胞和B细胞活化（CD4+/CD8+/CD19+＆CD69+）均有不同程度的提高,CD4+/CD8+T细胞的中央记忆性T细胞比例（CD4+/CD8+＆CD44+＆CD62L+）也有显著增加。综上所述,细菌样颗粒疫苗ZI-△-PA-GEM免疫后不仅可刺激机体产生有效的体液免疫应答,也可促进脾细胞增殖、多种细胞因子分泌、T/B淋巴细胞活化和增加中央记忆性T细胞比例。综上所述,本研究制备并筛选的ZIKV重组RABV ZI-E和细菌样颗粒ZI-△-PA-GEM,均可有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答;ZI-E可同时预防ZIKV和RABV两种病毒感染。本研究为寨卡病毒病新型疫苗的研制提供了新思路和研究基础。