结球性是蔬菜作物特有的农艺性状,在生菜、大白菜等蔬菜中均有出现。结球性有利于叶用蔬菜的栽培、采收、运输和贮藏。结球性是一个复杂的数量遗传性状,其遗传规律和分子机制尚不明晰。本实验室利用结球生菜和不结球生菜为亲本构建了生菜结球性状的分离群体,利用BSR-seq的方法鉴定到了两个控制生菜结球的QTL位点,分别命名为Lettuce Heading Locus1（LHL1）和LHL2。本实验室近期解析了LHL2位点编码的LsKN1调控生菜结球的分子机理。本研究将探索LHL1位点调控生菜结球的遗传和分子机理。1.构建仅由LHL1位点控制的结球分离群体。通过基因型筛选和自交纯化的方法得到了一个编号为Line355-F5的结球分离家系。在该分离群体中,结球和不结球表型呈质量性状分离,不结球个体数和结球个体数的比值约为3:1,符合单基因控制的性状的比例。该群体被用于LHL1基因的遗传定位。2.LHL1基因的图位克隆和功能验证。利用Line355-F5群体将LHL1基因定位于一个1.02 Mb的区间内,并成功克隆LHL1基因。LHL1基因编码一个BEL1-Like Homeodomain（BLH）家族的转录因子,其在拟南芥中的直系同源基因是SAW1（AT4G36870）,所以我们将LHL1基因命名为LsSAW1。在结球亲本中,Lssaw1基因的第一个外显子丢失了一个T碱基,导致移码突变和提前终止。我们猜测丢失功能的Lssaw1基因导致生菜的结球。通过在结球自交系中超量表达LsSAW1和在不结球自交系中CRISPR/cas9敲除LsSAW1,验证了LsSAW1基因就是LHL1,其功能的丢失会导致生菜的结球。3.LsSAW1调控网络的分析。我们利用BSR-seq、LCM-seq和ChIP-seq分析了LsSAW1转录因子参与的调控网络,分析结果显示,Lssaw1的功能丢失改变了许多基因的背腹性表达模式,在结球个体中,近轴基因有下调趋势,而远轴基因有上调趋势。LsSAW1可以直接结合多个叶背腹性基因的启动子区域。所以LsSAW1可能通过直接调控叶背腹性基因来调控生菜结球。4.LsSAW1直接转录调控叶背腹性基因。我们深入研究了LsSAW1对LsAS1和LsYAB1的转录调控。ChIP-seq、Y1H和EMSA实验结果表明LsSAW1可以结合LsAS1和LsYAB1的启动子区域;双荧光素酶报告实验和q RT-PCR结果表明LsSAW1转录因子可以促进LsAS1和抑制LsYAB1的表达。超量表达LsAS1基因可以使结球自交系变为不结球表型,超量表达LsYAB1基因可以使不结球自交系的叶片向内弯曲,进而促进结球的产生。所以,无功能的Lssaw1通过减少LsAS1基因的表达和增加LsYAB1基因的表达来促进生菜结球。5.LsSAW1与LsKN1互作。利用Y2H、Pull-down、Co-IP和Bi FC实验证明了LsSAW1和LsKN1的蛋白互作。LsSAW1/Lssaw1的差异表达基因和LsKN1▽/LsKN1的差异表达基因之间存在显著的交集,LsSAW1的靶基因和LsKN1的靶基因也存在显著的交集。证明LsSAW1和LsKN1转录因子参与相同的叶背腹性调控网络。差异表达基因的相关性分析和双荧光素酶报告实验证明了LsSAW1与LsKN1对下游基因的调控模式相反。6.LsSAW1的1-bp碱基缺失突变在自然群体中的分析。我们在488份野生生菜和242份栽培生菜中鉴定LsSAW1基因的1-bp碱基缺失突变,结果显示,该突变只存在于结球类型的栽培生菜中,说明LsSAW1的1-bp碱基缺失突变发生在生菜驯化之后,且该突变对结球生菜的形成具有重要意义。7.LsSAW2的功能分析。对5个菊科物种和拟南芥的BLH家族的氨基酸序列进行进化分析,发现了生菜中另外一个SAW1的直系同源基因LsSAW2。在结球自交系中超量表达LsSAW2,阳性苗的表型与LsSAW1的超量表达植株的表型非常相似,证明LsSAW2和LsSAW1编码的蛋白在结球调控中具有相似的功能。表达量分析显示LsSAW2在叶片中的表达量显著低于LsSAW1。LsSAW2的低表达导致了LsSAW2不能拯救Lssaw1突变体的结球表型。总结:本研究发现了一个新的参与叶背腹性调控的转录因子LsSAW1,无功能的Lssaw1通过抑制近轴基因表达和促进远轴基因表达来促进生菜结球的形成。LsSAW1与LsKN1蛋白互作,两者共同参与叶背腹性调控网络,并且协同调控生菜叶背腹性与结球性。本研究解析了生菜结球的遗传和分子机理,为结球蔬菜的育种提供了新的思路,为植物叶发育和叶背腹性调控网络的研究提供了新的基因资源。